Izolace tubulárních buněk z moči a jejich význam

Projekt si klade za cíl zavést a k rutinnímu využití optimalizovat metodu izolace proximálních tubulárních buněk (PTEC) z lidské moči jako (A) potenciální diagnostickou metodu („liquid kidney biopsy“) a (B) pro získání patofyziologicky relevantního experimentálního materiálu pro studium diabetické choroby ledvin.

V projektu budou využity vzorky moči zdravých dobrovolníků a postupně testovány a optimalizovány všechny kroky vedoucí k získání co nejhomogennější populace PTEC. Následně bude testována funkce mitochondrií jako korelát metabolické kondice v pilotním experimentu s PTEC exponovanými diabetickému mikroprostředí a SGLT2 inhibitoru in vitro (Seahorse XF Analyzer).

Tvorba a funkce moči

Tvorba moči je významný děj pro celý organismus. Krev je filtrována ledvinami v ledvinových tělískách. Vzniklý filtrát poté prochází řadou úprav v ledvinových kanálcích, až dojde k vytvoření definitivní moči. Složení definitivní moči se od původního filtrátu výrazně liší. Na tvorbě moči se podílejí tři hlavní mechanismy: filtrace krve, resorpce potřebných látek a sekrece odpadních látek.

Nefron - základní funkční jednotka ledvin

Základní funkční jednotkou pro tvorbu moči je nefron. Velice důležité je uspořádání samotného nefronu, který začíná corpusculum renale Malpighi, jenž je tvořeno glomerulem, do něhož vstupuje arteriola glomerularis afferens a vystupuje arteriola glomerularis efferens, a Bowmanovým pouzdrem. Samotný tubulus renalis má tři úseky.

Samotný glomerulus je tvořen fenestrovanými kapilárami bez diafragmy a díky velice jemnému řízení průtoku i tlaku krve v o něco širší a. afferens a o něco užší a. efferens zde dochází ke glomerulární filtraci do Bowmanova pouzdra. Viscerálním listem Bowmanova pouzdra jsou podocyty těsně naléhající svými pedikly na bazální membránu kapilár. Parietální list je tvořen plochým jednovrstevným epitelem. Filtrační bariéru tedy představuje endotel kapilár, bazální membrána a pedikly podocytů. Mezi výběžky pediklů je ještě rozprostřena štěrbinová membrána (slit diaphragm) tvořená například proteinem nefrinem. Mimo to v glomerulu ještě najdeme mezangium, které poskytuje mechanickou oporu, má fagocytární aktivitu a secernuje prostaglandiny. Mesangiální buňky mimo glomerulus s buňkami macula densa (konečná část vzestupného úseku Henleovy kličky) a s granulárními buňkami (modifikované buňky hladkého svaloviny a. afferens) tvoří juxtaglomerulární aparát.

Čtěte také: Metody separace buněčných komponent

Objem tekutiny, který je za časovou jednotku filtrován ve všech glomerulech, lze vyjádřit jako glomerulární filtraci (GFR). Norma je 120 ml/min/1,73m2 tělesného povrchu, tedy 180 l/den.

Pohyb tekutiny přes filtrační membránu je řízen a určován poměrem hydrostatického tlaku v kapilárách a onkotickým tlakem bílkovin v plazmě, méně pak hydrostatickým tlakem intersticiální tekutiny a onkotickým tlakem v této tekutině. Tyto síly se nazývají Starlingovy a je zde několik odlišností od obecných zásad. Jednak tekutina není vyměňována mezi kapilárou a intersticiem, ale mezi kapilárou a tekutinou Bowmanova pouzdra. Dále se liší hydrostatický tlak v kapilárách, pohyb je tedy pouze jednostranný, a to ve směru filtrace. A konečně - filtrační bariéra má unikátní strukturu a vlastnosti, které nedovolují prostupu bílkovin do filtrátu (primární moči).

Hlavní determinantou je průtok krve ledvinami, který je přímo úměrný rozdílu tlaků mezi a. a v. renalis a nepřímo úměrný perifernímu odporu vas afferens, vas efferens a arteria interlobularis. Při zvýšeném tlaku dojde ke kontrakci cévy a tím ke zvýšení periferního odporu. Při snížení tlaku nastává opačný proces. Postgangliový neuromediátor sympatiku noradrenalin vyvolává zejména ve vas afferens vazokonstrikci a tím sníží průtok krve ledvinou, a tedy i GF. Uplatňuje se zejména při stresových situacích, včetně bolesti a krvácení.

Chceme-li GF stanovit, což je jedním ze základních funkčních vyšetření ledvin, pak musíme použít látku, která se z těla vylučuje jen glomerulární filtrací (inulin, kreatinin) a tubuly pouze protéká. V praxi se ale využívá složitějších korigovaných výpočtů na povrch těla se zhodnocením i jiných tělesných parametrů.

Ledvinné tubuly a jejich funkce

Mezi tubulární procesy řadíme několik dějů probíhajících v ledvinných tubulech. Tedy v proximálním tubulu, Henleově kličce, distálním tubulu a ve sběracím kanálku. Jedná se o několik funkcí, které zajišťují udržení homeostázy v našem těle. Zejména vylučování odpadních produktů a nežádoucích látek, dále regulace hydratace organismu, regulace správné hladiny iontů, osmolality a v neposlední řadě i regulace pH. Filtrát vzniklý glomerulární filtrací (primární moč) je dále upravován buňkami tubulů. Některé látky jsou zpětně reabsorbovány do krve, jiné naopak sekretovány do lumen tubulů a následně vyloučeny v definitivní moči. Rozeznáváme tedy tubulární reabsorbci a tubulární sekreci.

Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací

Epitelové buňky tubulů mají v jednotlivých částech tubulu různou stavbu. Jejich membrány obsahují rozdílné kanály a přenašeče, proto se v různých částech tubulu transportují jiné látky, nebo stejné látky, ale různým způsobem. Na všech buňkách však rozeznáváme bazo-laterální a apikální (luminální) povrch. Tyto dva povrchy jsou odděleny pomocí takzvaných tight junctions (těsných spojů).

Tubulární reabsorpce

Reabsorbcí je myšleno zpětné vstřebání látek z primární moči. Jde tedy o transport z lumen tubulu skrz epiteliální membrány do intersticia a následně do peritubulárních kapilár. Z celkového filtrátu se zhruba 99 % zpětně vrací tubulární resorpcí do extracelulární tekutiny (zpět do těla). Hlavním úkolem tubulů je tedy izoosmotická resorpce (zpětné vstřebávání) primární moči. Kromě vody se vstřebávají například ionty (sodíku, chloru, draslíku, vápníku, hořčíku, bikarbonáty či fosfáty), močovina, glukóza či aminokyseliny. To vše probíhá nezávisle na množství extracelulární tekutiny v organismu - hovoříme o tzv. obligátní resorpci. Transport se uskutečňuje buď pasivně difúzí ve směru koncentračního nebo elektrického gradientu, primárně aktivním transportem proti gradientu (za přímé spotřeby makroergní sloučeniny), nebo sekundárně aktivním transportem (transportní bílkovina využívá koncentračního gradientu vytvořeného primárně aktivním transportem realizovaným jinou transportní bílkovinou). Látky mohou být transportovány transcelulárně nebo paracelulárně. Voda je transportovaná vždy pasivně.

Základem sekundárně aktivního transportu je Na+/K+-ATPáza umístěná na bazolaterální membráně. Tou se vytvoří koncentrační gradient pro sodík, jenž přestupuje dle svého elektrochemického gradientu z tubulární tekutiny do epitelových buněk přes apikální membránu. Transportní proteiny pak působí jako symportéry (umožní vstup sodným iontům, pokud s sebou strhnou ještě další látku), nebo antiportéry (umožní sodným iontům vstup, pokud je naopak do tubulární tekutiny vypuzena jiná látka).

• Proximální tubulus:
  • V první polovině proximálního tubulu jsou resorbované sodné ionty transportovány spolu s ionty bikarbonátovými a řadou látek (glukózou, aminokyselinami, laktátem, močovinou a fosfáty).
  • Důležitou úlohu zde hraje enzym karbonátdehydratáza (karboanhydráza), jež se vyskytuje v apikální membráně i intracelulární části epitelové buňky. Prvním krokem je sekrece H+ do tubulární tekutiny pomocí Na+/H+-antiportu, který se nachází v luminální (apikální) membráně buněk proximálního tubulu.
  • Glukóza, aminokyseliny a řada dalších organických látek se v této části tubulu za fyziologických podmínek resorbují kompletně. Kapacita této resorpce má ale určitou maximální hodnotu - hovoříme o tzv. renální/tubulárním prahu (tubulárním maximu). Pokud je toto maximum/práh překročeno (důsledkem příliš vysoké koncentrace látky v krevní plazmě - například 10 mmol/l pro glukózu), objeví daná látka v definitivní moči.
  • V druhé polovině proximálního tubulu jsou sodné ionty transportovány spolu s ionty chloridovými do intersticia jak transcelulárně (na bazolaterální membráně napomáhá K+/Cl--symport), tak paracelulárně. V tubulární tekutině zůstává relativní nadbytek kladných iontů (sodné, draselné, vápenaté, hořečnaté) a ty doprovází chloridy paracelulárně.
• Henleova klička:
  • V Henleově kličce se resorbuje asi 25 % solutů (tlustý segment vzestupného raménka), ale jen asi 15 % vody (sestupné raménko). To, že tlustá část vzestupného raménka je neprostupná pro vodu a má aktivní mechanismus na vstřebávání sodných a chloridových iontů, je zásadní pro vytvoření vysokého osmotického tlaku (hyperosmolarity) ve dřeni, který pak zajišťuje tvorbu koncentrované moči.
  • Resorpce iontů se zde děje obdobně jako v proximálním tubulu, velice důležitý je ale symport iontů sodných, draselných a chloridových, kdy se přes apikální membránu propouští jeden iont sodíku, jeden draslíku a dva chlóru.
• Distální tubulus a sběrací kanálek:
  • V distálním tubulu a sběracím kanálku se resorbuje zhruba 7 % solutů (zejména Na+ a Cl-) a přibližně 17 % vody. Protože je zdejší resorpce ovlivněna hormony (např. ADH), hovoříme o tzv. fakultativní resorpci.
  • V první části distálního tubulu jsou resorbovány především ionty sodné a chloridové.

Tubulární sekrece

Tubulární sekrece je aktivní transport látek z krve skrz epiteliální membrány do lumen tubulů. Tímto způsobem jsou z těla odstraňovány některé látky ovlivňující pH, nebo například i kreatinin. Tubulární sekrece napomáhá rychlejšímu vyloučení látek, které se glomerulární filtrací nepřefiltrují úplně. Místem tubulární sekrece je nejčastěji distální stočený kanálek. Takto jsou z těla odstraňovány ionty H+, K+ a amoniak. Tubulární sekrecí jsou také odstraňována z těla některá léčiva, například penicilinová antibiotika.

Regulace objemu moči a krevního tlaku

Na regulaci objemu a koncentrace moči se podílí především Henleova klička. Sestupné raménko Henleovy kličky je propustné pro vodu, ale není propustné pro ionty Na+. V intersticiální tekutině okolní dřeně je vysoká koncentrace iontů Na+, což způsobí přesun vody ze sestupného raménka Henleovy kličky do intersticia díky osmotickému gradientu. Tím dochází ke snížení objemu a zvýšení koncentrace filtrátu. Vzestupné raménko Henleovy kličky je neprostupné pro vodu, ale umožňuje resorpci iontů Na+ do intersticiální tekutiny. Tyto resorbované ionty vytvářejí gradient pro prostup vody ze sestupného raménka. Filtrát se díky resorpci iontů Na+ stává méně koncentrovaný.

Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět

Objem moči je regulován pomocí dvou hormonů: antidiuretický hormon (ADH) produkovaný zadním lalokem hypofýzy a aldosteron, který je produkován kůrou nadledvin. Antidiuretický hormon podporuje resorpci vody v distálním tubulu a ve sběrných kanálcích tím, že zvyšuje jejich propustnost pro vodu. Aldosteron zvyšuje resorpci sodíku v distálním stočeném kanálku aktivací Na+/K+ pumpy. Resorpce sodíku vyvolá osmotický gradient, díky kterému voda proudí z tubulu do intersticia.

Na řízení krevního tlaku se ledviny podílejí systémem renin-angiotensin-aldosteron. V blízkosti aferentních glomerulárních arteriol se nacházejí specializované buňky (juxtaglomerulární buňky), které neustále monitorují krevní tlak v arteriolách. Dalšími receptory jsou buňky, které jsou nahloučeny ve vzestupné části Henleovy kličky a distálního tubulu v místě kontaktu s ledvinovým tělískem (macula densa) a které monitorují množství NaCl v tubulárním filtrátu. Pokud juxtaglomerulární buňky zaznamenají snížení krevního tlaku v arteriolách nebo buňky macula densa detekují sníženou koncentraci NaCl v tubulárním filtrátu (v důsledku zpomalené glomerulární filtrace a rychlejší resorpce), juxtaglomerulární buňky zareagují sekrecí reninu. Renin je enzym, který katalyzuje přeměnu neaktivního angiotenzinogenu na aktivní angiotenzin. Angiotenzin vyvolá zúžení (vazokonstrikci) eferentních arteriol a stimuluje vyplavení aldosteronu z kůry nadledvin. Aldosteron podporuje vstřebávání sodíku a vody z distálního tubulu, čímž dojde ke zvýšení objemu krevní plasmy a zvýšení krevního tlaku.

Regulace acidobazické rovnováhy

Ledviny ovlivňují acidobazickou rovnováhu prostřednictvím sekrece a resorpce iontů H+. Normální pH krve je 7,4. Pokud poklesne pH krve (krev bude kyselejší v důsledku nadbytku iontů H+), v distálním kanálku budou ionty H+ secernovány do moči. Naopak pokud dojde ke zvýšení pH (krev bude zásaditější), ionty H+ budou zadržovány v krvi.

Produkce erytropoetinu

Pokud dojde ke snížení množství kyslíku (hypoxii) v peritubulárních kapilárách, buňky endotelu kapilár produkují hormon erytropoetin, který stimuluje kostní dřeň ke zvýšené produkci červených krvinek (erytrocytů).

Diabetická choroba ledvin (DKD)

Diabetická choroba ledvin a diabetická nefropatie jsou hlavní příčinou chronického onemocnění ledvin (CKD) a konečného stadia onemocnění ledvin (ESKD) v České republice i po celém světě. Ačkoli prevalence diabetu v České republice za posledních 20 let vzrostla, podíl lidí s diabetem, kteří mají také CKD, zůstal relativně stabilní mezi 25 až 30 procenty. Diabetes Mellitus (DM) odpovídá za 30 % až 50 % případů konečného stadia onemocnění ledvin v České republice.

Rozlišení diabetické nefropatie a diabetické choroby ledvin

"Diabetická nefropatie" je diagnóza, která odkazuje na specifické patologické strukturální a funkční změny pozorované v ledvinách pacientů s DM (jak typu 1, tak typu 2 Diabetes Mellitus [T1/T2DM]), které vyplývají z účinků DM na ledviny. "Diabetická choroba ledvin" (DKD) je klinická diagnóza založená na přítomnosti proteinurie, snížené odhadované glomerulární filtrace (eGFR) nebo obou u diabetu. Neznamená konkrétní patologický typ. Může pocházet z mnoha různých příčin, včetně hypertenzní nefrosklerózy a nevyřešeného akutního selhání ledvin. Pravděpodobnost, že "diabetická nefropatie" je příčinou diabetické choroby ledvin, se značně liší v závislosti na klinických okolnostech.

Patofyziologie DKD

Hyperglykémie vede k produkci pokročilých glykačních konečných produktů (AGE) a reaktivních forem kyslíku. Zatímco hyperglykémie nepochybně hraje ústřední roli, hyperinzulinémie a inzulinová rezistence mohou také vyvolávat patogenní mechanismy, pravděpodobně vysvětlující rozdíly v histopatologii mezi diabetem 1. a 2. typu. Patofyziologie vedoucí k rozvoji diabetické nefropatie a následného konečného stadia onemocnění ledvin vyplývá z diabetického prostředí vedoucího k tvorbě a cirkulaci pokročilých glykačních konečných produktů, tvorbě růstových faktorů a hemodynamickým a hormonálním změnám. Tyto změny vedou k uvolňování reaktivních forem kyslíku a zánětlivých mediátorů. Souhrnně tyto změny vedou k glomerulární hyperfiltraci, glomerulární hypertenzi, renální hypertrofii a změněnému glomerulárnímu složení, které se klinicky projevuje jako albuminurie a hypertenze.

S nástupem DM se velikost a hmotnost ledvin zvyšuje v průměru o 15 %, a toto zvětšení velikosti zůstává i po progresivním snížení funkce ledvin. Vyšetření ledvinové tkáně odhaluje ztluštění glomerulární bazální membrány a rozšíření mezangia. Klasická patologická léze diabetické nefropatie je nodulární povahy a byla poprvé popsána Kimmelstielem a Wilsonem v roce 1936. Noduly jsou typicky acellulární a pozitivní při barvení periodickou kyselinou-Schiff. Ačkoli tyto noduly jsou patognomonické pro diabetickou nefropatii, jsou hlášeny pouze u 10 % až 50 % bioptických vzorků od pacientů s T1/T2DM. Daleko častější je difúzní glomerulární léze, která je charakterizována difúzním rozšířením mezangiální matrix. Arteriální léze postihující aferentní i eferentní cévy jsou také výrazné a časté u DM.

Přirozený průběh diabetické nefropatie u pacientů s T1DM byl původně charakterizován u pacientů s DM s juvenilním nástupem koncem 70. let zkoumáním úmrtních záznamů pacientů, kteří byli klasifikováni jako zemřelí na selhání ledvin. Tato studie nám pomohla pochopit skutečný neléčený přirozený průběh diabetické nefropatie v důsledku T1DM před zavedením terapie diabetické nefropatie. Na základě této studie se proteinurie objevuje 11 až 23 let po diagnóze T1DM, koncentrace sérového kreatininu začíná stoupat po 13 až 25 letech a ESKD se vyvíjí po 18 až 30 letech. V současné době se mikroalbuminurie a makroalbuminurie označují jako A2 a A3 podle guideline KDIGO (Kidney Disease: Improving Global Outcomes) pro chronické onemocnění ledvin (CKD).

Přirozený průběh diabetické nefropatie u pacientů s T2DM, sledovaných v longitudinálních studiích, je v podstatě shodný s průběhem u pacientů s T1DM, ačkoli načasování nástupu diabetu u pacientů s T2DM je obtížné posoudit. Proto se pacient může dokonce prezentovat s proteinurií a na ledvinové biopsii mít diabetickou nefropatii ještě před diagnostikováním T2DM.

Jediným největším prediktorem zhoršení funkce ledvin a progrese diabetické nefropatie je proteinurie.

Diagnostika DKD

DKD obvykle nezpůsobuje symptomy, takže pokyny ADA a KDIGO doporučují měřit funkci ledvin a albuminurii při diagnóze a poté každoročně u T2DM a u diabetu 1. typu se doporučuje začít screening 5 let po diagnóze. Albuminurie se nejlépe hodnotí pomocí měření ACR (poměr albumin/kreatinin) z náhodných vzorků moči (ideálně z ranních vzorků); časované nebo 24hodinové sběry moči k měření exkrece albuminu jsou také vhodné, ačkoli méně pohodlné a náchylnější k chybám při sběru.

Pokud je zjiženo snížení eGFR nebo zvýšení albuminurie, mělo by to být potvrzeno opakovaným testováním po dobu 3 až 6 měsíců; minimálně dvě zvýšené hladiny ACR s odstupem více než 3 měsíců jsou nutné, než je jedinec považován za osobu se zvýšenou albuminurií. To je proto, aby se odlišily přechodné změny a také aby se zohlednila intraindividuální variabilita, která je pozorována u ACR.

Přístup k pacientovi s DM a známkami onemocnění ledvin se musí soustředit na určení, zda je onemocnění ledvin pacienta diabetická nefropatie nebo jiné onemocnění ledvin. Vývoj významné albuminurie před 5 lety nebo po 25 letech trvání T1DM snižuje pravděpodobnost diabetické nefropatie. Kromě toho, 95 % pacientů s T1DM a diabetickou nefropatií má také diabetickou retinopatii, takže absence retinopatie může naznačovat jinou diagnózu než diabetickou nefropatii. U T2DM je klinická diagnóza náročnější, protože tyto epidemiologické nápovědy nejsou tak užitečné. Diabetická retinopatie je shodná s diabetickou nefropatií pouze v asi 60 % až 65 % případů; proto její absence negeneruje vysokou negativní prediktivní hodnotu pro diagnózu diabetické nefropatie.

Atypická trajektorie poklesu eGFR nebo nástupu albuminurie, velmi závažná albuminurie (ACR > 300 mg/mmol nebo >3000 mg/g) nebo nefrotický syndrom a aktivní močový sediment mohou naznačovat jinou příčinu onemocnění ledvin.

Diferenciální diagnostika

Mezi další onemocnění ledvin, která je nutné odlišit od diabetické nefropatie, patří ischemická nefropatie, onemocnění ledvin spojené s dysproteinémií a tubulointersticiální nefritida (TIN).

Léčba DKD

Specifická léčba pacientů s diabetickou nefropatií může být rozdělena do 4 hlavních oblastí: snížení kardiovaskulárního rizika, glykemická kontrola, kontrola krevního tlaku a inhibice RAS a nově se objevující terapie včetně inhibitorů SGLT-2. Pacienti s diabetickou nefropatií mají nutně DM a proto je kardiovaskulární riziko významné. Je důležité zajistit agresivní modifikaci rizikových faktorů, obvykle ve spolupráci s praktickým lékařem pacienta. Součástí tohoto terapeutického přístupu je zanechání kouření a léčba snižující hladinu lipidů.

Účinek zlepšené glykemické kontroly na klinické výsledky, včetně progrese diabetické nefropatie, byl testován v mnoha velkých klinických studiích zahrnujících pacienty s T1/T2DM. Intenzivní kontrola glykémie vedla k relativnímu snížení rizika o 39 % pro rozvoj mikroalbuminurie a o 56 % pro manifestní proteinurii.

tags: #izolace #tubulárních #buněk #z #moči

Oblíbené příspěvky:

• Univerzální elegance bílého obkladu 20x20
• Řešení přesahu střechy na sousední pozemek
• Jak zabránit netvrdnutí epoxidu
• návod na barvení betonových stěn
• Realizace plotu v Ostravě Přívoze: Zkušenosti