Izolace rostlinných organel a ostatních buněčných komponent je nezbytnou podmínkou pro studium fyziologických i patologických procesů uvnitř rostlinné buňky. Díky izolaci je možné provádět analýzu buněčných struktur, zjišťovat kumulaci určitých metabolitů, iontů, enzymů a dalších látek. Cílem je získat části buňky schopné samostatné funkce. Používá se pro oddělení organel a makromolekul pro následnou analýzu jejich složení a funkcí. Jednotlivé makromolekuly mohou být poté dále izolovány a analyzovány, například pro určení proteinové poruchy.
Struktura rostlinné buňky
Rostlinná eukaryotická buňka je tvořena buněčnou stěnou na povrchu a buněčným obsahem - protoplastem. Protoplast je ohraničen jednoduchou cytoplazmatickou biomembránou - plazmalemou a obsahuje cytoplazmu s jádrem a ostatními buněčnými organelami, soustavou membrán, vakuolami, sférozómy a metaplazmatickými součástmi - inkluzemi. Všechny tyto části jsou rozptýleny v základní substanci - cytozolu - cytoplazmy. K organelám řadíme především jádro, plastidy a mitochondrie, které jsou ohraničeny dvojjednotkovou membránou, zatímco ribozómy, vakuoly, diktyozómy (z nichž se skládá Golgiho aparát), endoplazmatické retikulum a některé další ohraničují jednoduché membrány. Z uvedených struktur buňky lze optickým mikroskopem dobře sledovat buněčnou stěnu, jádro s jadérky, plastidy a vakuoly, případně některé buněčné inkluze jako škrobová zrna, krystaly a olejové krůpěje. Mitochondrie jsou na hranici rozlišitelnosti používaných školních světelných mikroskopů. Soustava membrán zastoupena endoplazmatickým retikulem a Golgiho aparátem (tzv. endomembránový systém) lze pozorovat pouze za pomocí elektronového mikroskopu. U živých rostlinných buněk se cytoplazma zpravidla pohybuje a toto proudění označujeme jako cyklóza. Rozlišujeme rotaci cytoplazmy, kdy se obsah buňky pohybuje jedním směrem podél buněčné stěny kolem centrální vakuoly a cirkulaci, kdy cytoplazma proudí různými směry kolem stěn, ale i v praméncích mezi vakuolami.
Buněčná stěna
Přítomnost buněčné stěny je jednou z charakteristik odlišujících rostlinnou buňku od živočišné. Buněčná stěna omezuje velikost protoplastu a zabraňuje narušení buňky při zvětšování souvisejícím s příjmem vody vakuolou. Buněčná stěna (BS) sestává ze čtyř skupin polymerů: celulózy, pektinu, hemicelulózy a proteinů. Celulózová kostra BS je prostoupena matrix necelulózních molekul, hemicelulózy a pektinových látek. Důležitou složkou je glykoprotein označovaný jako extenzin, dále se ve stěnách mnoha buněk vyskytuje lignin (sloužící ke zpevnění BS) a tukové látky - kutin, suberin a vosky, zabraňující ztrátám vody z rostlin impregnací BS. Mimo to mohou být BS inkrustovány anorganickými látkami. V rostlinných buňkách byly zjištěny dvě vrstvy BS: střední lamela a primární stěna. Střední lamela, složená hlavně z pektinových látek, se nachází mezi primárními stěnami přilehlých buněk. Proces lignifikace BS začíná právě ve střední lamele a pokračuje na primární, případně sekundární stěně. Primární stěna je složena hlavně z celulózy, hemicelulóz, pektinových látek (důležité pro plasticitu BS) a glykoproteinu. Ve stěně buněčné se často vyskytují ztenčeniny, tzv. tečky, nebo dvůrkaté ztenčeniny. U některých buněk se v průběhu vývoje vytváří i sekundární BS. K jejímu vytvoření dochází většinou po ukončení růstu buňky, kdy primární stěna není schopna dalšího plošného růstu. Sekundární BS obsahuje hlavně celulózu a lignin, pektinové látky a glykoprotein zde chybějí. Je tudíž neelastická. Proto jsou sekundární stěny důležité u specializovaných buněk sloužících ke zpevňování a k vedení vody.
Biomembrány
Všechny membrány jednotlivých organel mají jednotný princip molekulární organizace. Základní složkou všech biomembrán jsou molekuly lipidů (fosfolipidy a steroly) a bílkovin (globulární proteiny), v menší míře jsou zastoupeny sacharidy ve formě glykoproteinů nebo glykolipidů. Současná představa o molekulární strukruře biomembrán bývá označována jako model tekuté mozaiky. Nosným kontinuem je zde souvislá dvojitá vrstva molekul lipidů (bimolekulární film), na jejíž povrch jsou připojeny tzv. periferní proteiny, nebo do níž jsou přímo zabudovány tzv. integrální proteiny. Molekuly lipidů i proteinů jsou volně pohyblivé. Cytoplazmatická membrána neboli plazmalema je jednotkovou membránou oddělující cytoplazmu od buněčné stěny. Tvoří vysoce selektivní bariéru mezi vnitrobuněčným obsahem a okolním prostředím.
Jádro
Jádro je nejdůležitější strukturou uvnitř cytoplazmy eukaryotních buněk. Je ohraničeno dvojitou membránou, tzv. jaderným obalem (karyotékou). V jaderné plazmě se nacházejí tenké praménky a zrnka chromatinu. Chromatin je tvořen DNA spojenou s proteiny. Během buněčného dělení se kondenzací chromatinu vytvářejí chromozomy. V somatických buňkách většiny vyšších rostlin a živočichů je diploidní počet chromozomů - 2n, při tvorbě reprodukčních buněk, spor či gamet je počet chromozomů redukován na polovinu (haploidní počet - n). Optickým mikroskopem můžeme v jádru rozeznat kulovité struktury označované jako jadérka (jadérko - nucleolus). Jsou místy utváření ribozomů, tvořených RNA a proteiny.
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
Plastidy
Plastidy jsou lipoproteinové organely v rostlinných buňkách obsahující vlastní DNA a ribozomy. Chloroplasty jsou centry fotosyntézy. U vyšších rostlin jsou zpravidla diskovitého tvaru. Mají složitou vnitřní strukturu. Stroma je protkáno systémem membrán, vytvářejícím měchýřky tylakoidy. V chloroplastech se dále nacházejí grana - diskovité tylakoidy (připomínají štočky mincí). Tylakoidy gran jsou spojeny s tylakoidy stromatu. Barviva jsou přítomna na vnitřní straně tylakoidních membrán. Chromoplasty jsou různých tvarů. Leukoplasty neobsahují barviva. Mohou obsahovat škrob - amyloplasty, po úplném vyplnění škrobem je označujeme jako škrobová zrna. V zásobních buňkách jsou škrobová zrna různých tvarů, struktury a velikosti v závislosti na rostlinném druhu. K důkazu škrobu používáme Lugolův roztok, který jej vybarvuje tmavomodře. Leukoplasty obsahující bílkoviny se označují jako proteinoplasty a leukoplasty s tuky jsou elaioplasty.
Mitochondrie
Mitochondrie jsou organely menší než plastidy, ale obdobně jsou ohraničeny dvojjednotkovou membránou. Vnitřní membrána tvoří rozsáhlé záhyby a ploché vchlípeniny - kristy, nebo válcovité vchlípeniny - tubuly, které jsou obaleny kapalnou matrix. Mitochondrie jsou organelami, v nichž je lokalizován respirační metabolizmus buňky (dýchání).
Vakuoly
Vakuoly jsou organely rostlinné buňky ohraničené jednotkovou membránou - tonoplastem a vyplněné vodním roztokem - buněčnou šťávou. Základní složkou vakuolárního obsahu je voda, v ní jsou pak obsaženy soli, cukry, rozpustné proteiny, metabolity a ve vodě rozpustná barviva. Hydrofilní barviva jsou nerozpustná v tucích. Nacházejí se rozpuštěna ve šťávě buněčné vakuol a jsou glykosidické povahy. Antokyany jsou nejčastější, zbarvují četné květy, plody a listy červenolistých odrůd zelenin a květin. Antofein je vzácné hnědé barvivo.
Endoplazmatické retikulum a ribozomy
Endoplazmatické retikulum je složitý trojrozměrný membránový systém, který slouží jako komunikační sysytém uvnitř buňky. Transportuje různé materiály do různých částí buněk. Ribozomy jsou submikroskopické struktury vznikající v jadérku. Odtud přecházejí do cytoplazmy, kde se pak váží na membrány (např. ER) nebo jsou volné (např. v buněčném jádře, chloroplastech, mitochondriích...). Jejich základní funkcí je syntéza proteinů. Jsou tvořeny ribozomální RNA a proteiny. Každý ribozom je složen ze dvou oddělitelných podjednotek.
Cytoskelet a inkluze
Prostor mezi plazmalemou a jádrem buňky není vyplněn pouze cytoplazmou a organelami v ní rozptýlenými, ale obsahuje také vláknité a trubicovité útvary, tvořící síťovitou strukturu, označovanou jako cytoskelet. Polymerizací molekul proteinů (např. tubulinu a aktinu) vznikají vlákna - mikrotubuly (tvořené tubulinem) a mikrofilamenta (tvořena aktinem). Mikrotubuly se podílejí na růstu buněčných stěn určením směru celulózních mikrofibrilů, orientují i ostatní cytoplazmatické komponenty, jsou důležitými složkami flagel a cilií. Mikrofilamenta se spojují ve svazky, probíhají pod plazmalemou a spojují protilehlá místa cytoplazmy. V živých buňkách vznikají během jejího vývoje jako produkty metabolismu i rozmanité neživé elementy. Zůstávají-li v buňce, nazýváme je uzavřeniny - inkluze. Mezi kapalné inkluze patří buněčná šťáva vakuol, mezi pevné inkluze můžeme zařadit aleuronová zrna, proteinová tělíska, krystaly šťavelanu vápenatého a jiných solí (ve formě písku, styloidů, rafidů nebo drůz).
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
Homogenizace buněk
Homogenizace buněk je proces, při kterém dojde k rozrušení membrány buňky a uvolnění buněčných součástí do roztoku. Můžeme jí dosáhnout několika metodami. Orientačně se rozdělují mezi hrubé a jemné metody.
Metody homogenizace
- Rozdrcení kuličkami: Při této metodě využíváme drobné kovové nebo skleněné kuličky, které se v určitém poměru smísí s buňkami. Následným mícháním nebo třepáním dojde nárazy kuliček k rozdrcení membrán. Jemné metody jsou používané například pro buněčné kultury.
- Ultrazvukové rázy: Opakovanými ultrazvukovými rázy dochází k rozdrcení membrán. Nevýhodou této metody je, že generuje vysoké množství tepla, které může poškodit funkci součástí buňky a tím celý postup znehodnotit.
- Vysoký tlak: Při této metodě jsou buňky drceny vysokým tlakem. Příkladem pro to může být protlačování buněk úzkým otvorem, při průchodu kterým buňky prasknou.
- Mrazící a tající cykly: Buňky se opakovaně zmrazují (např. tekutým dusíkem) a nechávají roztát. Metoda je efektivní zejména pro živočišné buňky. Zmrzlá tkáňová kultura může být rozmixována jemným mixérem, přičemž dojde k mechanickému rozbití buněčné stěny a membrány.
- Enzymatické metody: S použitím enzymů specifických pro každou buněčnou kulturu dojde k natrávení složek buněčné membrány, případně stěny. Často se využívá v kombinaci s jinými metodami.
- Použití detergentů: S pomocí detergentu dojde k rozpuštění buněčné membrány. Opět se často využívá ve spojení s jinými metodami, aby se dosáhlo požadovaného účinku.
- Osmotický šok: V prostředí hypotonického roztoku buňka nasaje vodu, nabobtná a eventuálně dojde k jejímu prasknutí, čímž se uvolní její obsah do okolí.
Frakcionace a separace organel
Hrubou filtrací (např. přes gázu) můžeme oddělit nehomogenizované buňky od zbytku. Pro postupné oddělení složek se používá převážně centrifugace a ultracentrifugace.
Centrifugace
Na základě odlišné velikosti a objemu jednotlivých organel a makromolekul probíhá sedimentace v centrifugách odlišnou rychlostí. Nejprve sedimentují velké složky jako třeba buněčná jádra. Při vyšších rychlostech mitochondrie, poté zlomky endoplasmatického retikula. Při vyšších rychlostech a delším čase centrifugace se usadí malé váčky, poté ribozomy a menší částečky. Všechny tyto frakce nejsou nejprve čisté, ale oddělením usazeniny, jejím resuspendováním a opětovnou centrifugací je možné je purifikovat.
Izopyknická sedimentace (dělení na gradientu hustoty)
K izolaci buněk podle hustoty se používá centrifugace buněčné suspenze ve zkumavce naplněné médiem, které má v různých vzdálenostech ode dna různou denzitu - tzv. dělení na gradientu hustoty. K vytvoření spojitého gradientu se dnes nejčastěji používá částeček oxidu křemičitého potažených polyvinyl - pyrrolidonem (obchodní název Percoll®). Pokud se směs částic o různé velikosti centrifuguje při vysokých otáčkách, rozdělí se podle denzity. Médium u dna zkumavky má pak vyšší hustotu než médium u hladiny. Na povrch gradientu se nanese buněčná suspenze a celý sloupec se znovu centrifuguje, tentokrát při podstatně nižších otáčkách. Buňky klesnou až na úroveň, kde mají stejnou hustotu jako médium. Technicky jednodušší je příprava nespojitých gradientů. V tomto případě se na sebe jednoduše navrství roztoky o různých hustotách. Další vrstvu opět tvoří buněčná suspenze. Po centrifugaci se buňky rozdělí mezi jednotlivá rozhraní roztoků tak, že každý buněčný typ zůstane mezi roztokem s vyšší a nižší hustotou, než je hustota buněk. K přípravě diskontinuálních gradientů se používá celá řada chemikálií. Nejčastěji jde o sacharidy, od snadno dostupné sacharózy až po polysacharidy.
Nové metody izolace organel
Studovat složité mechanismy uvnitř buněk umožní vědcům nová metoda založená na analýze nízce koncentrovaných látek, jejichž detekce v buňkách byla dosud mimo rozlišovací schopnosti laboratorních přístrojů. Nový postup vyvinuli odborníci z Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci, Akademie věd České republiky a Umeå Plant Science Center ve Švédsku. I když byla nová metoda původně zacílena na rostlinné buňky, v budoucnu bude moci být aplikována i ve výzkumech mimo rostlinnou říši.
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
FAmOS (Fluorescence-Activated multi-Organelle Sorting)
Týmy vědců z Česka a Švédska před časem upřely pozornost na rostlinné hormony. Jedná se totiž o klíčové růstové látky, které v rostlinách regulují důležité vývojové procesy, avšak v rostlinných buňkách mají velmi nízkou koncentraci, což ztěžuje jejich detekci. Výzkumné skupiny Ondřeje Nováka a Karin Ljung sice již dříve analyzovaly rostlinné hormony na buněčné úrovni, ale narazily na možnosti dosud používaných analytických metod, jejichž rozlišení nebylo dostatečné pro měření rostlinných hormonů uvnitř buňky. Na základě distribuce proteinů zodpovědných za transport rostlinných hormonů v buňkách a mezi nimi vědci předpokládali, že samotné rostlinné hormony jsou také v rostlinných buňkách distribuovány nerovnoměrně. Nová analytická metoda umožňující detekovat látky o velmi nízkých koncentracích uvnitř buněk tuto teorii potvrdila.
Vědci novou analytickou metodu pojmenovali zkráceně FAmOS, neboli třídění buněčných organel na základě jejich fluorescence (Fluorescence-Activated multi-Organelle Sorting). Tato metoda je založena na označení čtyř různých organel v buňce odlišnými fluorofory - chemickými značkami, které vyzařují specifické barvy světla při osvícení laserovým paprskem. Tento přístup byl zvolen, protože předchozí techniky frakcionace byly příliš časově náročné a postrádaly společné rysy. Při použití různých metod k izolaci například buněčného jádra a chloroplastu nebyly koncentrace rostlinných hormonů ve dvou odděleně izolovaných organelách navzájem srovnatelné. Výzkumníci se také museli vypořádat právě s nízkou koncentrací rostlinných hormonů v rostlinných buňkách. Po oddělení buněčných organel byla měřena koncentrace rostlinných hormonů pomocí kapalinové chromatografie spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Vědci věří, že jejich nová metoda má velký potenciál pro četné budoucí aplikace. Není omezena pouze na rostlinné buňky, ale může být aplikována i na živočišné buňky. Jakmile jsou totiž buněčné organely roztříděny a odděleny, tak tato metoda umožňuje analyzovat i jiné látky než rostlinné hormony.
Tabulka 1: Přehled metod homogenizace buněk
| Metoda homogenizace | Princip | Výhody | Nevýhody / Poznámky | Využití |
|---|---|---|---|---|
| Rozdrcení kuličkami | Mechanické rozdrcení membrán pomocí kovových/skleněných kuliček | Efektivní, zvláště pro buněčné kultury | Může způsobit poškození organel | Buněčné kultury |
| Ultrazvukové rázy | Rozdrcení membrán opakovanými ultrazvukovými rázy | Relativně rychlá | Generuje teplo, které může poškodit buněčné součásti | Obecná homogenizace |
| Vysoký tlak | Buňky prasknou při protlačování úzkým otvorem pod vysokým tlakem | Účinná metoda | Potřeba speciálního vybavení | Široké spektrum buněk |
| Mrazící a tající cykly | Opakované zmrazování (tekutým dusíkem) a tání buněk | Efektivní | Zejména pro živočišné buňky, může dojít k poškození membrán | Živočišné buňky, tkáňové kultury |
| Enzymatické metody | Natrávení složek buněčné membrány/stěny enzymy | Šetrné k organelám | Dlouhá doba, specificita enzymů | Často v kombinaci s jinými metodami |
| Použití detergentů | Rozpuštění buněčné membrány detergentem | Rychlá metoda | Detergenty mohou narušit funkci organel | Často ve spojení s jinými metodami |
| Osmotický šok | Buňka praskne v hypotonickém roztoku nasátím vody | Jednoduchá metoda | Použitelné pro buňky bez buněčné stěny (protoplasty) | Protoplasty, buňky bez pevné stěny |
tags: #izolace #organel #rostlinne #bunky #metody