Fenoly jsou těkavé, organické sloučeniny, které se běžně vyskytují v přírodě a obsahují skupinu -OH. Tyto látky jsou produkovány mikroorganismy, rostlinami i živočichy, včetně lidí. Některé přirozené fenoly jsou zodpovědné za chuť a barvu potravin. Díky svým účinkům na lidský organismus jsou mnohé fenoly předmětem medicínských výzkumů.
Člověkem vytvořené fenoly se do prostředí uvolňují během výroby, manipulace a likvidace produktů, ve kterých jsou obsaženy. Typickým zdrojem fenolů je spalování organického materiálu, jako jsou motory, ohniště nebo tabákový kouř.
Vlastnosti a využití fenolů
Samotný fenol je v čisté podobě bezbarvá nebo bílá pevná látka, avšak nejčastěji se vyskytuje jako tekutina. Má výrazný sladký zápach, který působí dráždivě. Vypařuje se pomaleji než voda a snadno se v ní rozpouští. Fenoly se řadí do skupiny těkavých organických látek (VOC).
Své uplatnění nalezly v chemickém průmyslu při výrobě plastů, pesticidů a dalších látek, při zpracování dřeva a v kožedělném průmyslu. Fenol se nejvíce používá při výrobě plastů, ale také kaprolaktamu, látky určené pro výrobu nylonu 6 a dalších umělých vláken, a bisfenolu A. Je hlavním chemickým meziproduktem používaným při výrobě fenolových pryskyřic a chemických vláken. Dále se využívá jako protislizový prostředek (slimicidy - chemikálie používané pro zamezení růstu bakterií a houbového slizu) v průmyslových vodních systémech, jako desinfekční prostředek a ve farmacii jako součást prostředků proti bolení v krku a kožním onemocněním.
Podobně jako alkoholy jsou fenoly schopné tvořit oxoniové soli, estery a fenoláty. Ve srovnání s alkoholy jsou kyselejší, a proto lze k přípravě fenolátů použít i hydroxidy alkalických kovů. Fenoly s jednou hydroxylovou skupinou jsou poměrně stálé vůči oxidaci, zatímco fenoly se dvěma -OH skupinami v poloze ortho a para se oxidují za porušení aromatického kruhu.
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
Dopad na lidské zdraví
Člověk může být fenolům vystaven vdechnutím, pozřením a kožním kontaktem. Toxické projevy závisí na konkrétním fenolu. Obecně platí, že vysoké koncentrace fenolů mohou ohrozit schopnost krve transportovat kyslík, což se projevuje bolestí hlavy, nevolností, modráním končetin a rtů. Mohou se dostavit poruchy dechu, bezvědomí i smrt. Vysoké opakované expozice mohou způsobit poškození jater, ledvin a centrální nervové soustavy.
Nadměrné působení chemikálií z této početné skupiny může způsobovat řadu různých zdravotních problémů v závislosti na konkrétní chemikálii. Nadměrné působení fenolu může způsobit poškození mozku, zažívacího traktu, očí, srdce, ledvin, jater, plic, periferních nervů, pokožky a nenarozených dětí. Fenol může také způsobit genetické poruchy.
Do lidského organismu se může fenol dostat vypitím kontaminované vody, požitím kontaminovaných potravin nebo spolknutím výrobků obsahujících fenol. Fenol se také velmi dobře dostává do těla stykem s pokožkou. Do organismu může proniknout i při kouření nebo dýcháním vzduchu případně kouře, který obsahuje fenol.
Množství fenolu, které se do těla dostane při kontaktu kontaminované vody s kůží, závisí na množství fenolu ve vodě a na délce kontaktu vody s kůží. Větší množství fenolu se do těla dostane spíše při styku slabého roztoku fenolu s větší plochou pokožky, než při kontaktu silnějšího roztoku pouze s malou částí těla. Je-li člověk vystaven fenolu ve vzduchu, může tato látka do těla proniknout kůží i plícemi. Kůží může proniknout i polovina z celkového množství fenolu, který se ze vzduchu do organismu dostane. Lidé mohou být fenolu vystaveni také dýcháním vzduchu na skládkách.
Fenoly v životním prostředí
V atmosféře podléhají fenoly rychlé degradaci (některé fenoly jsou zdrojem chlóru). Fenol se také nachází v emisích motorových vozidel a v cigaretovém kouři, stejně jako v kouři z otevřených ohnišť a lesních požárů. Chlorfenoly se tvoří během spalování odpadů s obsahem chloru.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
Malé jednorázové úniky fenolu ve vzduchu nezůstávají dlouho (poločas rozpadu bývá méně než 1 den) a ani v půdě fenol obvykle nezůstává příliš dlouho (většinou zcela zmizí po dvou až pěti dnech). Ve vodě dokáže fenol setrvat až 9 dní. Větší množství jednorázově vypuštěného fenolu nicméně zůstává v uvedených složkách životního prostředí mnohem déle, podobně jako při dlouhodobém unikání menšího množství této látky.
Více fenolu bývá nacházeno hlavně v povrchových vodách a v ovzduší poblíž kontaminovaných míst, kam fenol unikl z průmyslových zařízení anebo přímo z výrobků, které jej obsahují. Přítomnost fenolu byla zjištěna v materiálech ukládaných na skládky nebezpečného odpadu a poblíž takových míst se pak vyskytoval také v podzemní vodě.
Fenol je mírně toxický pro vodní živočichy (ryby jsou obecně nejvíce citlivé). Chlorované fenoly jsou toxické zejména pro vodní organizmy. Fenol je zařazen do kategorie těkavých organických látek (VOC), které mohou potenciálně přispívat k tvorbě přízemního ozonu a fotochemického smogu.
Regulace a limity
Normy environmentální kvality (NEK-RP) vyjadřují celoroční průměrnou hodnotu. Není-li uvedeno jinak, použije se na celkovou koncentraci všech izomerů. Příloha č. k vyhlášce 401/2015 Sb., Tabulka 2: Emisní standardy: přípustné hodnoty znečištění pro odpadní vody vypouštěné z vybraných průmyslových a zemědělských odvětví:
- Pro výrobu koksárenských produktů je limit 0,5 mg/l.
Příloha č. 1 k nařízení vlády č. 61/2003. Emisní standardy ukazatelů přípustného znečištění odpadních vod: Emisní standardy: přípustné hodnoty znečištění pro odpadní vody vypouštěné z vybraných průmyslových a zemědělských odvětví - Tepelné zpracování uhlí: fenoly jednosytné: přípustná hodnota 1 mg/l.
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
Nonylfenoly (4- nonylfenol), oktylfenoly (4-(1,1',3,3'-tetramethylbutyl)-fenol) a pentachlorfenol* se řadí mezi zvlášť nebezpečné závadné látky nebo prioritní nebezpečné látky.
Fenoly v izolaci DNA při zkoumání znečištění
Izolace DNA je proces získání DNA ze zkoumaného vzorku pomocí kombinace fyzikálních a chemických metod. Získaná DNA slouží například pro forenzní biologii nebo rekombinantní DNA technologie. Kvalita templátové DNA ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.
Pokud se DNA izoluje z buněk, například z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, nebo leukocytů periferní krve, je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží.
Fenol-chloroformová extrakce
Nejčastěji používaným denaturačním a precipitačním činidlem bývá fenol. Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi. Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z roztoku např. jejím vysolením nebo pomocí jednoduchých alkoholů (etanolu nebo izopropanolu).
Fenol-chloroformová extrakce je technika, při které se ke vzorku přidá fenol denaturující proteiny, které se vysráží na mezifázi vytvářené mezi fenolovou a vodnou fází. Zbytky fenolu jsou odstraněny přidáním chloroformu, který se pro svou vysokou hustotu snadno odděluje od vodné fáze. Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA.
Prvním krokem fenol-chloroformové metody je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny. Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny.
Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol). Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).
Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.
Další metody izolace DNA
Mezi další metody izolace DNA patří:
- Lýze buněk: Zajišťuje rozbití buněčné stěny a uvolní DNA. Používá se kombinace fyzikálních a chemických postupů. Důležitou roli hraje využití detergentů, které rozrušují membrány.
- Srážení alkoholem: Nejčastěji ethanolem nebo isopropanolem, ve kterých DNA není rozpustná a je možné izolovat centrifugací.
- Izolace pomocí minikolony: Využívá schopnost DNA vázat se na sklo nebo křemelinu v přítomnosti chaotropních solí, které jsou schopny vytvářet vazby zároveň se záporně nabitým sklem i záporně nabitou DNA. Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.
- Magnetická separace: DNA se reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).
tags: #stnosti #fenolu #izolace #rna #informace