Regenerace svalové tkáně je komplexní proces, který je klíčový pro obnovu funkce svalů po zranění. S drobným poškozením se kosterní svaly často dokážou samy opravit regenerací svalových vláken a obnovením svalové síly. Jakmile dojde ke zranění svalu, myogenní prekurzorové buňky jsou schopné iniciovat rychlý a účinný růst a regeneraci.
Role satelitních buněk v regeneraci svalů
Převládajícím zdrojem myogenních prekurzorových buněk jsou satelitní buňky. Satelitní buňky jsou malé jednojaderné progenitorové buňky, které se nacházejí mezi bazální membránou a sarkolemou jednotlivých vláken kosterního svalstva. Podílejí se na normálním růstu svalů, stejně jako na regeneraci po zranění nebo nemoci. Jejich primární funkcí je zprostředkovat postnatální růst a opravu svalů. V nepoškozeném svalu většina satelitních buněk zůstává klidná; avšak v reakci na mechanické namáhání nebo zranění se satelitní buňky aktivují. Když svalové buňky podstoupí zranění, klidné satelitní buňky reagují na zranění a jsou uvolněny ze svého výklenku. Satelitní buňky mohou být aktivovány tak, aby daly vzniknout kosterním myoblastům. Myoblasty se pak diferencují a tvoří postmitotické myotuby. Tyto myotuby mohou usnadnit regeneraci a opravu svalů fúzí do existujících sousedních myofibril.
Patologické procesy a hojení svalů
Patologický proces, který narušuje post-traumatickou regeneraci svalové tkáně, začíná přibližně 2 týdny po zranění a může trvat až 2 týdny. Hojení svalů je regulováno mnoha biochemickými cestami, ve kterých hrají důležitou roli zánětlivé cytokiny a růstové faktory. Vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) nebo kombinace VEGF a inzulinu podobného růstového faktoru (IGF) byly široce používány k vyvolání aktivace, proliferace a migrace myoblastových buněk. VEGF se může vyskytovat v různých izoformách, které vznikají z proximálního nebo distálního sestřihového místa.
Složení a vlastnosti oligo az anhydrit amnionu
Oligo az anhydrit amnion zahrnuje použití alginátu nebo jiného polysacharidu s relativně nízkou molekulovou hmotností, přednostně velikosti, která je po rozpuštění na renálním prahu pro clearance u lidí, např. alginát nebo polysacharid je redukován na molekulovou hmotnost 1000 až 80 000 daltonů. Přednostně je molekulová hmotnost 1000 až 60 000 daltonů, zvláště přednostně 1000 až 50 000 daltonů. Oligo az anhydrit amnion je třída materiálů tvořících hydrogely, která byla široce využívána v tkáňovém inženýrství a aplikacích pro dodávání léčiv. Jsou to přirozeně odvozené polysacharidy, extrahované z hnědých řas. Algináty byly používány v potravinářském průmyslu a medicíně kvůli jejich vysoké biokompatibilitě a výhodným fyzikálním a chemickým vlastnostem.
Alginátové hydrogely se snadno vyrábějí a zpracovávají a mohou být snadno formovány do definovaných struktur a tvoří trojrozměrné matrice v hydratovaném stavu. Vysoký obsah vody je další jedinečnou vlastností, která způsobuje, že alginátové hydrogely připomínají nativní tkáně, a proto je činí dobrým kandidátem pro materiály buněčné kultury pro opravu tkání.
Čtěte také: Komplexní průvodce potěry do dřevostaveb
Typy alginátových scaffoldů
Algináty jsou všestranné polysacharidové polymery, které mohou být formulovány pro specifické aplikace řízením molekulové hmotnosti, rychlosti degradace a metody tvorby scaffoldů. Vytvářejí se do různých typů scaffoldů. Injekční hydrogely mohou být vytvořeny z roztoků alginátu s nízkou molekulovou hmotností po přidání síťovacích činidel, jako jsou vápenaté ionty, zatímco makroporézní scafoldy se tvoří lyofilizací disků alginátu s vysokou molekulovou hmotností. Algináty jsou polyelektrolytové systémy, které mají silnou afinitu k dvojmocným kationtům (např. Ca2+, Ba2+). Biodegradovatelné gely byly vytvořeny kombinací molekulových hmotností polymerů.
Kombinace s růstovými faktory a buňkami
Hydrogel zahrnuje vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) nebo kombinaci VEGF a inzulinu podobného růstového faktoru (IGF). IGF-1, pravděpodobně kvůli své menší velikosti (7,5 Kda) a své neheparinové vazebné povaze, vykazoval rychlejší uvolňování; ve skutečnosti bylo přibližně 80% celkového naloženého IGF uvolněno během prvních 24 hodin, poté bylo v následujících týdnech pozorováno udržované uvolňování 0,05%. Naopak, udržované uvolňování bylo pozorováno u dvou heparin-vázajících proteinů bFGF a HGF, jak bylo dříve popsáno. Uvolňování bylo vysoké (80-90%) s IGF-1, a to bylo významné zlepšení ve srovnání s kontrolou (prázdný alginátový scaffold bez jakýchkoli faktorů) a IGF v koncentraci 12,5 ng/gel.
Satelitní buňky se sklízejí z léčeného jedince a zavádějí se do hydrogelů obsahujících růstové faktory. Byly použity primární myoblasty a buněčné linie C2C12 a GFP-PMM23.8. Myoblasty byly odvozeny od 4-12 týdnů starých myší C57BL/6 a transgenních Tg(ACTbEGFP)1Osb, konstitutivně exprimujících GFP ve všech buňkách, kosterní svalovině. Byly přecedeny přes 70 μm síto, centrifugovány při 1600 ot./min po dobu 5 min a resuspendovány v DMEM s vysokým obsahem glukózy, s přidaným pyruvátem (Gibco). Médium bylo dále doplněno 10% fetálním bovinním sérem (FBS) a 10% penicilinem/streptomycinem (P/S, Gibco) a toto bylo použito ve všech studiích buněčné kultury (jak pro primární, tak pro buněčné linie). Buňky byly zasazeny a kultivovány při 37 °C / 5% CO2 po dobu 72 hodin před výměnou média.
Příprava a dodání
Před dodáním do lidského těla je takový hydrogel lyofilizován a stlačen před podáním subjektu pro regeneraci svalové tkáně. Minimálně invazivní dodání je charakterizováno provedením pouze malého řezu do těla. Například hydrogel se podává do svalu subjektu pomocí jehly nebo angiokatétru. Takové materiály jsou vhodné pro minimálně invazivní dodání.
Skafoldy byly ochlazeny na -80 °C a gely byly lyofilizovány a skladovány při -20 °C. Gel byl jemně nalit na modifikované polymerové scafoldy s otevřenými póry. Gely byly inkubovány po dobu asi 20 minut před přidáním 500 μl kompletního kultivačního média.
Čtěte také: Podrobnosti o tloušťce anhydritové podlahy
Kvantifikace prokázala, že IGF-1, pravděpodobně kvůli své menší velikosti (7,5 Kda) a jeho neheparinové vazebné povaze, vykazoval rychlejší uvolňování; ve skutečnosti bylo přibližně 80% celkového naloženého IGF uvolněno během prvních 24 hodin, poté bylo v následujících týdnech pozorováno udržované uvolňování 0,05%. Naopak, udržované uvolňování bylo pozorováno u dvou heparin-vázajících proteinů bFGF a HGF. IGF-1 a VEGF byly předem smíchány s rekombinantním lidským VEGF165 proteinem (velkoryse poskytnutým Biological Resources Branch of the National Cancer Institute) a/nebo s rekombinantním lidským IGF1 (R&D System), v konečné koncentraci 60 pg/ml pro každý protein; in vitro kinetika uvolňování byla měřena pomocí ELISA. Směsi se nechaly gelovat po dobu 30 minut a udržovaly se při 4 °C. Gely byly chlazeny na -80 °C a lyofilizovány a skladovány při -20 °C.
Aplikace a výsledky
Implantace zařízení vede k regeneraci a opravě svalů po delší dobu, např. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 týdnů nebo déle po implantaci. Kvantifikace hustoty krevních cév v tibialis svalech byla provedena 3 dny a 6 týdnů po indukci myotoxického/ischemického zranění a léčbě prázdným alginátovým gelem, alginátovým gelem dodávajícím VEGF a IGF-1, alginátovým gelem dodávajícím buňky a VEGF a IGF-1, bolusovou dodávkou buněk a VEGF a IGF-1 v PBS a kontrolní končetinou. LDPI analýza krevního průtoku zadních končetin myší C57 ošetřených prázdným alginátovým gelem, alginátovým gelem dodávajícím VEGF a IGF-1, alginátovým gelem dodávajícím buňky a VEGF a IGF-1 a bolusovou dodávkou VEGF a IGF-1 v PBS.
Tetanická síla předních tibiálních svalů myší byla měřena po 3 dnech, 2 a 6 týdnech po léčbě. Tetanická síla byla normalizována na hmotnost každého svalu, aby se získala specifická síla korigovaná na hmotnost. Stimulace byla vyvolána paralelními drátěnými elektrodami s šířkou pulzu 2,0 ms a dobou trvání vlaku 1 s, a maximální stimulace byla měřena při 15V-300 Hz.
Hindlimb ischemie vedla u kontrolních zvířat k závažné gangréně prstu nebo nohy, ale léčba alginátovým gelem s VEGF a VEGF/IGF do značné míry ušetřila končetiny od nekrózy. Potvrdila aktivní regenerační proces vyvolaný dodáním růstových faktorů.
Mikroskopické zkoumání a morfologie scaffoldů
Průměrná velikost pórů, vypočtená z SEM snímků, byla 412 ± 17 μm. Lyofilizovaný porézní 5% 1LMW:1HMW scaffold vykazoval 98% pórovitost s vysokou konektivitou oválných pórů o průměru v rozmezí 0,009 až 0,130 mm. Konfokální zobrazování PMMGFP buněk rostoucích na RGD modifikovaném 5% 1LMW:1HMW scaffold po 30 minutách po osazení a po 2 týdnech v kultuře bylo provedeno. Vzorky byly sušeny a pokryty kovovou vrstvou před analýzou pomocí skenovacího elektronového mikroskopu. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí ANOVA testu.
Čtěte také: Možnosti využití starých trámů v kombinaci s anhydritem
| Léčebná skupina | Hustota krevních cév (3 dny) | Hustota krevních cév (6 týdnů) | Tetanická síla (2 týdny) | Tetanická síla (6 týdnů) |
|---|---|---|---|---|
| Prázdný alginátový gel | Nízká | Nízká | Nízká | Nízká |
| Alginátový gel + VEGF + IGF-1 | Střední | Vysoká | Střední | Vysoká |
| Alginátový gel + Buňky + VEGF + IGF-1 | Vysoká | Velmi vysoká | Vysoká | Velmi vysoká |
| Bolusová dodávka buněk + VEGF + IGF-1 v PBS | Střední | Střední | Střední | Střední |
| Kontrola (neporušená končetina) | Normální | Normální | Normální | Normální |
Tabulka: Předběžná srovnání hustoty krevních cév a tetanické síly v různých léčebných skupinách.
tags: #oligo #az #anhydrit #amnion