Ribonukleová kyselina (RNA) hraje klíčovou roli v mnoha biologických procesech. Její manipulace a modifikace otevírají nové cesty v chemické biologii a mají potenciál v terapii dosud neléčitelných chorob. Vědecký tým z Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR, vedený prof. Michalem Hockem, vyvinul novou metodu přípravy RNA obsahující modifikované báze. Tato inovace spočívá ve využití upravených DNA polymeráz, které se běžně používají pro syntézu DNA, ale nyní byly upraveny tak, aby uměly syntetizovat RNA.
Převratná metoda přípravy modifikované RNA
V přírodě DNA polymerázy syntetizují pouze DNA, zatímco RNA polymerázy produkují RNA. Hockův tým využil dvě uměle upravené DNA polymerázy, o kterých se vědělo, že umějí syntetizovat RNA. Vyvinuli postup přípravy modifikované RNA, který má oproti běžně dostupné metodě (in vitro transkripci s virovou T7 RNA polymerázou), užívané například při výrobě známých vakcín, značné výhody.
- Upravené DNA polymerázy umějí začlenit v podstatě jakoukoliv úpravu do jakékoliv sekvence RNA.
- Modifikace lze provést pouze na vybraných místech, přesně tam, kde je tato úprava žádaná.
Běžně používaná T7 RNA polymeráza umí zabudovat modifikovanou bázi pouze do všech pozic v RNA, a nikoli na jedno přesně určené místo. Tam, kde je třeba RNA cíleně modifikovat jen ve specifických místech, klasická in vitro transkripce selhává a je nutné hledat jiný přístup.
Metodika vyvinutá týmem z ÚOCHB je v mnoha ohledech srovnatelná s běžně užívanou in vitro transkripcí, přitom ale vychytává většinu jejích nevýhod a nabízí zcela nové možnosti. Touto novou metodou lze připravit různé specifické RNA sondy pro studium biologie RNA, což je v současné době velmi žhavé téma. Pro modifikace mRNA zvolili vědci dvě konkrétní pozice a zjistili, že v takovém případě se výrazně zvýší produkce určitých bílkovin. To je pro vývoj potenciálních mRNA léčiv výborná zpráva.
Potenciál mRNA léčiv
Pokud by se podařilo vpravit do buněk takto modifikovanou mRNA, pak by bylo možné spustit v těle výrobu proteinu, kterého má tělo nedostatek nebo který je nějak poškozený. „Naše metoda může vést k vývoji terapeutik pro léčbu mnoha chorob, včetně rakoviny a některých genetických onemocnění, které zavinil nějaký nefunkční nebo chybějící protein.“
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
Výzvou zůstává, jak zajistit, aby bylo proteinu v ten správný okamžik právě to správné množství. Ani málo, ale ani ne moc. U většiny bílkovin totiž platí, že když je jich příliš mnoho, tak organismu škodí. Proto se mRNA v buňce přirozeně rychle odbourává a celý proces je tělem velmi jemně regulovaný. Podle Michala Hocka je jasné, že jejich metoda klasickou in vitro transkripci nenahradí. Pokud ale bude nezbytné, aby se specifické modifikace vyskytovaly jen na vybraných místech RNA, tak výhodu bude mít právě metoda z ÚOCHB.
Původní článek o této metodě: Brunderová, M.; Havlíček, V.; Matyašovský, J.; Pohl, R.; Poštová Slavětínská, L.; Krömer, M.; Hocek, M. Expedient production of site specifically nucleobase-labelled or hypermodified RNA with engineered thermophilic DNA polymerases. Nat. Commun. 2024, 15, 3054.
Optimalizace izolace RNA z tukové tkáně
Cílem práce III. interní kliniky bylo optimalizovat izolaci RNA z tukové tkáně a ověřit její parametry. Tuková tkáň (cca 100 mg) byla odebrána pacientům při chirurgických výkonech. Vzorek tkáně byl uchován ve stabilizačním činidle RNAlater. Celková RNA byla izolována pomocí různých kitů.
Materiály a metody
- Vzorky: Tuková tkáň (cca 100 mg) odebrána pacientům.
- Stabilizace: Vzorky uchovány ve stabilizačním činidle RNAlater.
- Izolační kity:
- Rneasy Protect Mini (QIAGEN GmbH, Německo)
- Rneasy Lipid Tissue (QIAGEN GmbH, Německo)
- MagNA Pure Compact RNA Isolation (Tissue) pro přístroj MagNA Pure Compact Instrument (Roche Diagnostics GmbH, Německo)
- Hodnocení kvality RNA: Výtěžky, poměry absorbance A260/280 nm, detekce 28S a 18S rRNA, RT-PCR a QRT-PCR.
Výsledky izolace RNA
Výsledky ukázaly rozdílné výtěžky RNA v závislosti na použitém kitu, avšak s vysokou čistotou a amplifikovatelností.
| Izolační kit | Výtěžek RNA (μg/ml) | Počet vzorků (n) | Poměr A260 nm/280 nm |
|---|---|---|---|
| Rneasy Protect Mini Kit | 37,5 ± 20,7 | 63 | 1,6-2,0 |
| Rneasy Lipid Tissue Kit | 85,9 ± 36,3 | 29 | 1,6-2,0 |
| MagNA Pure Compact RNA Isolation Kit (Tissue) | 50,6 ± 13,6 | 28 | 1,6-2,0 |
Poměry R260 nm/280 nm byly v rozmezí 1,6-2,0, což naznačuje dobrou čistotu RNA. Validace postupů hodnocená prostřednictvím RT-PCR potvrdila podobnou míru schopnosti amplifikace vzorků RNA. Přesnost postupu byla do 7 %. Celková RNA nebyla kontaminována DNA s výjimkou vzorků z RNeasy Protect Mini Kit.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
Rneasy Lipid Tissue Kit a MagNA Pure Compact RNA Isolation Kit (Tissue) splňují požadavky kladené na izolaci RNA z tukové tkáně a poskytují RNA vzorky vysoké kvality, čistoty a PCR amplifikovatelnosti. RNA byla velmi úspěšně použita k RT-PCR a QRT-PCR.
Doplňující informace k metodám izolace RNA
V případě jednoho DNA čipu znamená 10-50 µg celkové RNA. Inhibitory RNázy a doba lyzace činila 12 hodin při teplotě 60°C. Kvalita RNA je klíčová pro další experimenty.
Bylo zjištěno, že RNA byla nepoužitelná pro vysoký stupeň degradace v mezidobí od získání tkáně do završení její fixace. Je důležité minimalizovat toto mezidobí. Kovalentně modifikuje RNA. Archivovaných v parafinových bločcích. Byla vždy zachována zřetelná detekce 28S i 18S rRNA. QRT-PCR.
Je určen pro rychlou extrakci DNA z různých tkání a buněk a následnou genotypizaci extrahované DNA metodou PCR. Inhibuje reakce katalyzované terminální transferázou nebo polynukleotid kinázou. Inertní neutrální nosič, neinhibuje DNA-protein interakce a enzymové reakce. Neinterferuje s určováním koncentrace RNA/DNA. Purifikovaný glykogen (zbavený DNA, RNA a proteinů), neinhibuje většinu DNA-protein interakcí a enzymových reakcí. Neinterferuje s určováním koncentrace RNA/DNA. Může inhibovat některé DNA-protein interakce.
Tato práce byla podpořena grantem IGA MZČR. Datum přednesení příspěvku: 26. 5. na XXVIII. Brněnských onkologických dnech a XVIII. Konferenci. Autoři: prof. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D.; J. Pacholíková; MUDr. Pavel Fabián, Ph.D.; Ing.
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
tags: #motivacni #dopis #a #metody #izolace #rna