Kmenové buňky jsou nediferencované buňky mnohobuněčného organismu, které mají schopnost produkovat neomezeně mnoho buněk stejného typu. Vyznačují se pozoruhodným potenciálem vyvinout se v těle do mnoha různých typů buněk během raného stavu života a růstu. Nejcharakterističtějším rysem kmenových buněk je jejich schopnost obnovovat se buněčným dělením a jejich schopnost přeměnit se na tkáňově nebo orgánově specifické buňky se speciálními funkcemi. V některých orgánech, jako je střevo a kostní dřeň, se kmenové buňky pravidelně dělí, aby opravily a nahradily opotřebované nebo poškozené tkáně.
Mezenchymové kmenové buňky (MSC)
Mezenchymální stromální/kmenové buňky (MSC) nabízejí vysoký potenciál pro mnohostranné terapeutické využití v regenerativní a estetické medicíně. Nacházejí se především v kostní dřeni, ale mohou být izolovány i z jiných tkání (např. chrupavky, tuku, svalových buněk). MSC jsou definovány jako nehematopoetické kmenové buňky, vyznačující se expresí povrchových markerů: CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 a CD106. Ve tkáni se vyskytují v „niche“, v prostorech, kde mají kmenové buňky ideální prostředí pro svou existenci. Pokud je niche zničena nebo narušena, MSC ztrácí vlastnosti kmenové buňky a diferencuje se do běžné buňky tkáně, ve které se nachází. Pokud je zničena kmenová buňka, avšak niche zůstane nedotčena, brzy niche osídlí jiná kmenová buňka.
Terapeutický potenciál MSC
Výzkum a léčba kmenových buněk se používá ke kultivaci tkání a orgánů pro účely transplantace (tkáňové inženýrství). Další lékařské obory pro aplikaci kmenových buněk lze nalézt v léčbě onemocnění mozku (např. Parkinsonova a Alzheimerova choroba), terapii buněčného deficitu, krevních chorobách (např. leukémie), degeneraci kloubů a chrupavek (např. osteoartróza) a také v kosmetických ošetřeních (např. ošetření proti stárnutí). MSC pomáhají regenerovat poranění kožního krytu a mají účinky i na nervový systém - byla prokázána jejich podpůrná regenerační funkce na poškozených periferních neuronech, podobně jako na poraněné míše. Pomáhají regenerovat a nově tvořit hepatální tkáň a studuje se jejich vliv na vaskulární choroby.
Imunomodulační vlastnosti MSC
Další z vlastností MSC je jejich možnost imunomodulace. Sami o sobě jsou MSC imunologicky preferované buňky, mají tedy sníženou expresi MHC I. i II. třídy a neexprimují CD40, CD80 a CD86 (kostimulační molekuly nutné pro aktivaci T-lymfocytů). Suprimují tvorbu dendritických buněk a aktivitu T-lymfocytů, B-lymfocytů a NK buněk (natural killers). Výsledkem je snížení imunity potlačením a zpomalením tvorby i dozrávání imunitních složek. Tento imunosupresivní efekt se využívá ve výzkumu léčby řady onemocnění. V nedávné studii autoři ověřovali, zda je možné využít mezenchymální kmenové buňky ke zvýšení protiinfekční imunity u pacientů s oslabeným imunitním systémem. Studie ukázala, že kmenové buňky by mohly pomoci pacientům na imunosupresivní léčbě zvýšit imunitu, aby nebyli vysilováni infekcemi, které je mohou i ohrozit na životě.
Izolace kmenových buněk zubní dřeně (KBZD)
Zubní dřeň představuje relativně snadno dostupný zdroj postnatálních mezenchymových kmenových buněk. Tím, že je izolována od okolních struktur tvrdými zubními tkáněmi, zachovává si specifické mikroprostředí, nazývané „niche“, které ovlivňuje vlastnosti uložených kmenových buněk izolovaných ze zubní dřeně (KBZD). Oddělená zubní dřeň si uchovává stavbu typickou pro primitivní (embryonální) tkáně, KBZD by proto měly vykazovat některé vlastnosti podobné embryonálním kmenovým buňkám. KBZD jako postnatální kmenové buňky mají tu výhodu, že dárce nebo jeho zákonný zástupce může dát informovaný souhlas s jejich využitím. KBZD byly poprvé izolovány v roce 2000 a jejich schopnost sebeobnovy, diferenciace ve zralé buněčné typy in vitro a vysoký proliferační potenciál byly poprvé popsány v roce 2002. Od té doby se jeví jako velmi slibný zdroj buněk pro regenerativní medicínu. Extrakce zubu se provádí jako plánovaný výkon a zub spolu se zubní dření je považován za biologický odpad a je po extrakci likvidován. Využití těchto tkání pro izolaci KBZD tak pro pacienta nepředstavuje operační výkon navíc. Nejčastěji, v 77,6 % případů, jsou za těmito účely využívány třetí moláry, které jsou často extrahovány z důvodu retence či semiretence. Druhou nejčastější skupinou, využívanou v 10,7 % případů, jsou první premoláry, které jsou v indikovaných případech extrahovány z ortodontických důvodů okolo 12. roku věku. Jedná se tak často o intaktní zuby s nedokončeným vývojem kořene. Třetí nejčastěji využívané zuby jako zdroj KBZD jsou nadpočetné zuby.
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
Metody izolace KBZD
V současné době existují dvě metody izolace KBZD. Prvním krokem, který je společný pro obě metody, je oddělení zubní dřeně od tvrdých zubních tkání extrahovaného zubu.
- Metoda enzymatického štěpení (ED): Při enzymatické izolaci se suspenze KBZD získává štěpením tkáně působením enzymů. Nejčastěji se jedná o směs kolagenázy typu I a dispázy v poměru koncentrací 1:1. Doba působení enzymů je okolo 30-60 minut, různí se dle velikosti izolované tkáně. Výsledkem štěpení je suspenze jednotlivých buněk různého původu, zbytky cév a extracelulární matrix. KBZD poté adherují ke dnu kultivační nádoby a při výměně média se ostatní nečistoty odstraní.
- Metoda spontánního vycestování z tkáně: Ačkoliv je technika spontánního vycestování technicky méně náročná, všeobecně více využívaná metoda k izolaci mezenchymálních kmenových buněk je enzymatická izolace. KBZD získané touto metodou vykazují vyšší proliferační aktivitu, diferenciační potenciál a vyšší schopnost mineralizace.
Hilkens s kol. ve své pozdější práci demonstrovali, že pokud jsou KBZD izolovány od stejného dárce, kultivovány za stejných podmínek, nezáleží na použité metodě, jelikož nezpozorovali signifikantní rozdíl v morfologii, proliferační aktivitě či diferenciačním potenciálu mezi izolovanými KBZD.
Optimalizace izolačního protokolu pro KBZD
Cílem studie bylo optimalizovat proces izolace KBZD, zejména zkrátit dobu, po kterou je zubní dřeň enzymaticky štěpena. Extrahováno bylo celkem pět stálých zubů od dárců ve věku 14 až 18 let (jeden mesiodens, dva semiretinované třetí moláry a dva první premoláry s nedokončeným vývojem kořene).
Postup izolace
- Extrakce zubu probíhala v lokálním znecitlivění za aseptických podmínek.
- Odstranění mikrobiálního povlaku sterilní gázou a dekontaminace zubu 0,2% roztokem chlorhexidin glukonátu.
- Uložení zubu do transportního média (HBSS a aqua pro injectione v poměru 1:9, obohacené o antibiotika a antimykotika).
- Transport do laboratoře tkáňových kultur.
- Izolace zubní dřeně za sterilních podmínek: u zubů s nedokončeným vývojem kořenového systému se dřeň oddělila přes foramen apicale (min. šířka 2 mm); jinak pomocí zubní sondy a mikrochirurgické pinzety.
- Rozstříhání zubní dřeně na fragmenty do 1 mm3 a homogenizace ve směsi transportního média a PBS.
- Enzymatické štěpení: přidání 1 ml 0,05% trypsinu a inkubace v termální vodní lázni při 37 °C po dobu 10 minut.
- Inhibice působení enzymu přidáním 3 ml inaktivačního média (α-MEM a 20% FBS).
- Primokultura KBZD: po odsátí supernatantu nasazení do kultivační nádoby a kultivace v atmosféře 5% CO2 při 37 °C v modifikovaném médiu (α-MEM) obohaceném o 2% FBS, růstové faktory (EGF, PDGF), L-askorbovou kyselinu, glutamin, dexametazon, antibiotika a Insulin-Transferrin-Sodium-Selenium supplement (ITS).
- Pasážování buněčné linie při dosažení 70% splývavosti, nasazení buněk v koncentraci 5000 buněk/cm2. Kultivace ukončena po dosažení 8. pasáže.
Analýza buněk
- Proliferační aktivita a velikost buněk: Měřena v každé pasáži pomocí přístroje Z2-Counter.
- Viabilita buněk: Zjišťována na základě obarvení neviabilních buněk trypanovou modří pomocí analyzátoru Vi-Cell v 2. a 8. pasáži.
- Fenotypová analýza: Pomocí průtokové cytometrie (Cell Lab Quanta) v 3. a 7. pasáži. Buňky byly obarveny imunofluorescenčními protilátkami proti povrchovým znakům (CD10, CD13, CD18, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD49f, CD63, CD73, CD90, CD105, CD106, CD117, CD146, CD166, HLA I a HLA II, STRO1).
- Diferenciace: K ověření schopnosti diferenciace ve zralé buněčné typy (osteoblasty, chondroblasty a adipocyty) byla použita komerčně dodávaná média a standardně využívané diferenciační protokoly. Pro osteodiferenciaci bylo použito Differentiation Basal Medium-Osteogenic (Lonza, USA). Pro diferenciaci v adipocyty byly KBZD nechány dorůst do 100% splývavosti, následně kultivovány v médiu hMSC Adipogenic Induction SingleQuots (Lonza, USA) po dobu tří dnů, poté v hMSC Adipogenic Maintenance SingleQuots (Lonza, USA) po dobu tří dnů (opakováno celkem třikrát). Pro průkaz chondrogenní a osteogenní extracelulární matrix bylo využito imunohistochemické i histologické barvení. Pro průkaz tukových vakuol v adipocytech bylo použito barvení olejovou červení.
Výsledky izolace KBZD
KBZD byly kultivovány do 8. pasáže. Buňky dosáhly průměrně 47,8 ± 2,0 populačních zdvojení (PD). Průměrný čas potřebný pro zdvojení populace (DT) činil 39,2 ± 6,1 hodin. Po celou dobu kultivace byly buňky proliferačně aktivní. Průměrná viabilita v 2. pasáži byla 92,3 ± 1,5 % a v 8. pasáži 92,4 ± 1,4 %. Fenotypovou analýzou byla prokázána vysoká exprese povrchových antigenů pro mezenchymové kmenové buňky (CD13, CD29, CD44, CD90), pro tzv. „stromal associated“ znaky CD73, CD166, a naopak nízká či nízce pozitivní exprese znaků CD31, CD34, CD45, typických pro endoteliální a hematopoetickou buněčnou řadu. KBZD se diferencovaly ve zralé buněčné typy, osteoblasty a chondroblasty. Podařilo se optimalizovat izolační protokol pro KBZD tím, že se zkrátila doba enzymatického štěpení zubní dřeně. KBZD izolované touto metodou prokazovaly po celou dobu kultivace vysoký proliferační a diferenciační potenciál. Nebyly zpozorovány žádné známky spontánní diferenciace či degenerace.
Izolace kmenových buněk z tukové tkáně pomocí ultrazvuku
Sonikace je vysoce účinná mechanická metoda pro izolaci kmenových buněk z lidské tukové tkáně. Ultrazvukem izolovaná stromální vaskulární frakce (SVF) vykazuje významný regenerační potenciál pro lékařské aplikace. Z lidského těla extrahovaná tuková tkáň (liposukcí) se léčí ultrazvukem, aby se odstranila tkáň z kmenových buněk a dalších růstových buněk. Ultrazvuková izolační technika kmenových buněk z tukové tkáně je založena výhradně na principu činnosti ultrazvukové kavitace, což je čistě mechanické smykové tření. Tyto kavitační smykové síly narušují tukovou tkáň, takže kmenové buňky jsou uvolněny ze struktury tukové tkáně.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
Výhody ultrazvukové izolace
Vzhledem k tomu, že enzymatické štěpení pro izolaci kmenových buněk je doprovázeno vysokými náklady a možnými bezpečnostními riziky, stejně jako nedostatečnou účinností, upřednostňují se metody neenzymatické izolace, jako je ultrazvuková kavitace. Publikovaná metoda izolace stromální vaskulární frakce pomocí ultrazvukového kavitačního výtěžku v 1,67-2,24 × 107 buňky s životaschopností 97,1-98,9 % (Victor, S., 2014). Ultrazvukem připravené buňky mají stejně vysoký adipogenní a osteogenní diferenciační potenciál ve srovnání se standardní metodou enzymatické izolace (Oberbauer et al. 2015).
Zařízení a sterilita
Aby byla zajištěna nejvyšší bezpečnost a nejlepší kvalita, je klíčovým faktorem pro úspěšnou léčbu pacientů spolehlivé ultrazvukové zařízení, které umožňuje přesnou kontrolu nad léčbou kmenovými buňkami. Pro proces izolace kmenových buněk pomocí přímé sonikace je ultrazvukový roh (sonotroda, ultrazvuková špička / sonda) ponořen do tukové tkáně. Prostřednictvím sonotrody jsou ultrazvukové vlny spojeny přímo do autologního tuku, takže ultrazvuková kavitace uvolňuje kmenové buňky a stromální buňky ze zbytkové tkáně. Vzhledem k tomu, že kmenové buňky se používají pro autologní aplikace, je sterilita procesu velmi důležitá. Hielscher proto vyvinul několik možností nepřímé sonikace, jako je např. VialTweeter. Nepřímou sonikací jsou ultrazvukové vlny spojeny přes nástěnný kontejner do tukové tkáně. Nepřímý proces sonikace nabízí výhodu zpracování buněk v uzavřené nádobě pod podmínkami bez kontaminace, protože je eliminováno riziko křížové kontaminace vložením ultrazvukového rohu (sonotrody). Hielscher digitální sonikátory lze přesně ovládat pomocí dotykového displeje nebo ovládání prohlížeče. Postupy sonikace lze přednastavit pomocí intuitivního menu. Ultrazvuková zařízení jsou vybavena automatickým záznamem dat (všechna data procesu sonikace jsou uložena na integrované SD kartě).
Izolace buněk CD34+ pro výzkum hematopoetických kmenových buněk
Terapie multipotentními hematopoetickými kmenovými buňkami (HSC) se stává stále populárnější díky široké škále zdravotních přínosů a výzkumnému potenciálu. Protein CD34 je považován za primární marker HSC a hematopoetických progenitorových buněk, protože je exprimován na většině těchto buněk. Současný proces používaný k izolaci CD34+ HSC je časově náročný a obvykle vede ke značné ztrátě buněk.
Platforma MARS®
Platforma MARS® překonává překážky v izolaci buněk CD34+. Tato technologie průtokového vzorkování bez použití kolon zajišťuje nejen bezkonkurenční flexibilitu v optimalizaci pracovního postupu, ale také maximalizuje čistotu a míru výtěžnosti. Můžete přímo izolovat cílové buňky - i ty s nízkým procentuálním zastoupením - ze vzorků, včetně PBMC, periferní krve, CBMC, pupečníkové krve nebo kostní dřeně. Mobilizovaná krev se často používá jako zdroj buněk CD34+ a představuje základní kámen pro průlomy ve výzkumu HSC a terapeutických inovacích. Buňky CD34+ nejenže otevírají cestu k hlubšímu poznání hematopoézy a hematologických poruch, ale hrají také klíčovou roli v regenerativní medicíně.
Platforma MARS® zvyšuje čistotu, životaschopnost a výtěžek buněk CD34+. Lze snížit náklady na analýzu o působivých 60 % a zkrátit dobu experimentu téměř o 50 % u vstupního vzorku 50 ml. MARS® platforma nabízí bezkonkurenční snadnou separaci buněk. Zkracuje celkový i praktický čas téměř o hodinu a dodržuje plynulý pracovní postup: od protokolu označování rovnou ke dvěma (nebo volitelně třem) MARS® imunomagnetické izolaci. Náš intuitivní pracovní postup zaručuje vysokou čistotu a vynikající míru obnovy buněk s minimálními časovými nároky na práci. Automatizované obohacování buněk v jednom až třech průchodech zajišťuje efektivitu v každém kroku, spolu s izolací bez použití matrice, nákladově efektivním spotřebním materiálem a opakovaně použitelnou fluidikou. Navíc lze vzorky rychle znovu projít magnetickým kanálem, což zvýší provozní efektivitu.
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
Bezpečnost aplikace mezenchymových kmenových buněk
Mezenchymální buňky mají široké využití v medicíně, hlavně v regenerační a v léčbě autoimunitních onemocnění. Hledají se další možnosti, jak je využít. Proto jsou již od počátku jejich používání obavy z hlediska bezpečnosti. Velký důraz vědci při vývoji léčivých přípravků věnují právě této problematice. V rychle se množících buňkách v laboratoři i v organismu může docházet k mutacím, které mohou vést ke zvratu v buňku nádorovou. Taktéž aplikace velkého množství buněk může v místě podání rozvinout zánětlivou reakci a otok. V malých žílách hrozí riziko embolie. Pro zhodnocení bezpečnosti se využívá několik metod.
Metody zhodnocení bezpečnosti
- Je důležité mít jistotu, že se jedná opravdu o mezenchymální kmenové buňky a že v nich nedochází k mutacím či jiným změnám. Využívá se jejich povrchových značek, které se označí obarvenými protilátkami a změří na průtokovém cytometru. Tento přístroj obsahuje laser, který osvítí celý povrch buňky a spočítá, kolik buněk má na svém povrchu značky pro mezenchymální kmenové buňky.
- Dále je důležité sledovat růst buněk pod mikroskopem a jejich vlastnosti.
- V další fázi se využívá pokusných zvířat, u kterých se sleduje reakce na podávání buněk.
Studie potvrzují, že léčba mezenchymálními buňkami je bezpečná, s minimem nežádoucích účinků a nevznikají negativní reakce ani u příjemců dárcovských buněk, jelikož imunitní systém na cizí kmenové buňky nijak nereaguje. Vznik nádorových onemocnění nebyl u mezenchymálních kmenových buněk prokázán, naopak vznikají studie, které využívají MSC v léčbě těchto onemocnění (např. nádorů).
Retrospektivní analýza lokálních nežádoucích reakcí
V nedávné studii autoři aplikovali dárcovské MSC 164 koním do šlach a kloubů a sledovali reakci na příjem buněk. Předmětem sledování byl otok, zvýšená teplota a bolestivost končetiny. Buňky byly aplikovány do více šlach dle poškození, celkem bylo provedeno 230 aplikací. Jednalo se o různé typy poranění (nejvíce povrchového ohybače prstu, dále hlubokého ohybače, mezikostního svalu či přídatných vazů, případně kloubní vazy) diagnostikované klinicky a sonograficky. Ze všech 230 aplikací se nežádoucí reakce objevily pouze u 10 případů. Jednalo se většinou o otok, bolestivost a kulhání, které časem odeznělo.
| Celkový počet aplikací | Počet koní | Počet nežádoucích reakcí | Typ nežádoucích reakcí |
|---|---|---|---|
| 230 | 164 | 10 | Otok, bolestivost, kulhání |
Bezpečnost každého léčivého přípravku je důležitým bodem v jeho vývoji.
tags: #izolace #mezenchymovych #kmenovych #bunek #přehled