Izolace DNA je základním krokem v mnoha molekulárně-genetických technikách. Ačkoli pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) někdy stačí velmi malé množství DNA, kvalita templátové DNA významně ovlivňuje účinnost amplifikace. Nečistoty ve vzorku mohou působit jako inhibitory polymerázy nebo se vázat na templátovou DNA a zpomalovat tak reakci. Proto je purifikace DNA klíčová pro spolehlivé výsledky.
Výběr a příprava vzorků
DNA lze teoreticky izolovat z jakékékoli živočišné tkáně obsahující živé buňky. U organismů malé velikosti se k izolaci používají i celí jedinci, což však nese riziko kontaminace parazity, symbionty a potravou. U jednobuněčných živočichů se někdy nejprve jedinec (nebo několik jedinců) rozmnoží a DNA se izoluje ze všech jedinců najednou.
Zdroje DNA u obratlovců a savců
- U obratlovců, jejichž erytrocyty mají jádro, se DNA dá snadno izolovat z krve (např. u malých druhů ptáků).
- U savců je izolace DNA z krve problematičtější a vyžaduje poměrně velké množství (několik mililitrů) krve.
- U malých savců nebo obojživelníků lze velmi kvalitní DNA získat z čerstvé ledviny nebo svaloviny. Často však vystačí i odstřižený konec ocásku nebo část prstu, aby nebylo nutné zvíře usmrtit.
- Pomocí speciálních technik je možné izolovat DNA i z jednotlivých chlupů nebo trusu, tyto techniky jsou však poměrně obtížné a citlivé na kontaminaci.
Izolace z muzejního a starého materiálu
DNA lze často izolovat i z muzejního materiálu, přičemž dobrým zdrojem jsou hlavně tkáně uchovávané v lihu. Naopak izolace DNA ze vzorků, které přišly do styku s formalínem, často končí neúspěchem. DNA se občas podaří získat i z velmi starých vzorků (desítky tisíc let starých), jako jsou fosilní kosti (např. z neandrtálce) nebo hmyz uchovaný v jantaru. Větší šance na úspěch je u kostí dlouho uchovávaných v chladném prostředí (například v permafrostu). Při takových izolacích je však třeba postupovat velmi opatrně a pečlivě, neboť riziko kontaminace je veliké. Používají se speciální přetlakové místnosti a pracovníci používají speciální obleky, aby maximálně omezili kontaminaci vzorku svou vlastní DNA.
Základní principy izolace DNA
Pokud se DNA izoluje z buněk (např. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží.
Metody extrakce a purifikace DNA
Volba metody extrakce DNA závisí na jejím dalším použití. V některých případech postačí i DNA horší kvality a nízké koncentrace, v extrémním případě lze použít i jen zlyzované buňky. Nicméně, s kvalitně izolovanou DNA se vždy pracuje lépe. Pro izolaci se používá celá řada různých protokolů a často se využívají komerčně vyráběné soupravy (kity), které však bývají dražší.
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
1. Organická extrakce: Fenol-chloroformová metoda
Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA a je považována za „zlatý standard“ purifikace nukleových kyselin. Ačkoli je časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA.
Postup fenol-chloroformové metody:
- Homogenizace a lýza buněk: Tkáň se homogenizuje v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS), jenž rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny.
- Denaturace a vysrážení bílkovin: Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Přidává se malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění.
- Separace fází: Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi, např. lipidy.
- Vysrážení DNA: Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z roztoku, například jejím vysolením (přidáním vysoké koncentrace solí jako chlorid sodný nebo octan sodný) nebo pomocí jednoduchých alkoholů (etanolu nebo izopropanolu). Ionty soli si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo.
- Promývání a rehydratace: Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).
Je třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.
2. Extrakce na pevné fázi (silikátová extrakce)
Tato metoda využívá křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněna krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá a hodí se i pro automatizaci.
3. Magnetická separace
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).
Příklad postupu izolace DNA z neseparované krve pomocí magnetických kuliček:
- Do 1,5 ml zkumavky vpravit 1 ml DNA vazebného pufru, 50 µl DNA bind partikulí (po extenzivním protřepání a míchání) a 50 µl krve s EDTA. Směs inkubovat 10 min.
- Centrifugovat na mikrocentrifuze 30 sec.
- Odmýt peletu (obsahující DNA vázanou na kuličky) dvakrát 1 ml 70% etanolem a poté jednou 1 ml acetonu. Peletu vysušit 10 min.
- Přidat 100 µl elučního pufru, vortexovat a inkubovat 10 min při 56 °C, dojde k uvolnění DNA z DNA bind partikulí.
- Centrifugovat 30 sec.
- Odebrat supernatanta (obsahujícího purifikovanou DNA).
Další modifikace a optimalizace
Snaha maximálně zjednodušit laboratorní protokoly vedla k řadě modifikací izolace DNA. Jednou z nich je nahrazení pufru s proteinázou roztokem obyčejného pracího prášku ve vodě (0,025 g/ml), kdy se tkáň musí v roztoku prášku dokonale homogenizovat. Při použití kvalitního extrakčního pufru s proteinázou K tento krok není nutný. Další modifikace se používá k izolaci DNA určené pro následující amplifikaci pomocí PCR, kde je extrakční pufr v zásadě shodný s pufrem používaným při této metodě (s přidáním proteinázy). Při izolaci tkání uchovávaných ve formalínu se v prvních krocích izolace někdy přidává DTT (až ve 100mM koncentraci) nebo se využívají speciální kity.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
Stanovení koncentrace a uchování DNA
Koncentraci izolované DNA určíme spektrofotometrem nebo pomocí elektroforézy v málo koncentrovaném agarózovém gelu a srovnáním se standardy, které naneseme na gel společně se studovaným vzorkem. Izolovanou DNA před použitím obvykle zředíme vodou a zásobní koncentrovaný roztok uchováváme v mrazničce.
| Metoda | Princip | Výhody | Nevýhody | Vhodnost pro automatizaci |
|---|---|---|---|---|
| Fenol-chloroformová extrakce | Lýza, enzymatická digesce proteinů (proteináza K), denaturace a separace proteinů fenolem a chloroformem, vysrážení DNA alkoholem. | Vysoký výtěžek, vysoká čistota DNA. | Časově náročná, používá nebezpečné chemikálie (fenol, chloroform), nutné odstranění zbytků chemikálií. | Obtížná. |
| Silikátová extrakce (pevná fáze) | DNA se váže na dehydratovaný povrch křemičitých kuliček v přítomnosti chaotropních solí, kontaminující látky se odmývají. | Relativně jednoduchá, dobrý výtěžek a čistota. | Ano. | |
| Magnetická separace | DNA se reverzibilně váže na magnetické kuličky (potažené silikátem, protilátkami atd.), kuličky s DNA se oddělí magnetem a promyjí. | Vhodná pro velké počty vzorků, koncentrovanější DNA, výtěžky a čistota srovnatelné se silikátovou extrakcí. | Ano. |
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
tags: #izolace #dna #ze #zvirat #princip #a