Základním předpokladem pro úspěšné molekulárně-genetické vyšetření, jako je například polymerázová řetězová reakce (PCR), je získání kvalitního vzorku nukleových kyselin. I když někdy stačí jako vzorek velmi malé množství DNA, kvalita templátové DNA zásadně ovlivňuje účinnost amplifikace. Nečistoty obsažené ve vzorku mohou reakci výrazně zpomalovat tím, že působí jako inhibitory polymerázy nebo se váží na templátovou DNA, čímž ji činí pro reakci nedostupnou.
Základní principy izolace DNA
Proces izolace DNA z buněk (např. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice nebo leukocytů periferní krve) zahrnuje několik klíčových kroků:
- Homogenizace a lýza: Prvním krokem je narušení tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů, jako je dodecylsíran sodný (SDS).
- Odstranění kontaminací: Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek. Proto následuje extrakce a purifikace, při níž se bílkoviny hydrolyzují proteázami, denaturují a vysráží.
- Precipitace DNA: Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná nízkomolekulárními látkami. Následuje proto její vysrážení z roztoku pomocí vysoké koncentrace solí (vysolování) a jednoduchých alkoholů (etanolu nebo izopropanolu).
Srovnání metod izolace DNA
Metody používané pro získání čisté DNA se liší svou náročností, výtěžností i možnostmi automatizace.
| Metoda | Výhody | Nevýhody |
|---|---|---|
| Fenol-chloroformová extrakce | Vysoký výtěžek a čistota ("zlatý standard") | Časová náročnost, nebezpečné chemikálie, obtížná automatizace |
| Silikátová pevná fáze | Jednoduchost, vhodná pro automatizaci | Vyžaduje specifické pufry a centrifugaci |
| Magnetická separace | Vhodná pro velké počty vzorků, vysoká koncentrace DNA | Nutnost specifických magnetických kuliček |
Fenol-chloroformová technika
Tato metoda je stále považována za „zlatý standard“ purifikace nukleových kyselin. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K, což je účinný bakteriální enzym s teplotním optimem kolem 60 °C. Po přidání směsi fenolu a chloroformu dojde při pH nad 7,6 k denaturaci proteinů, které přecházejí do hydrofobní fáze, zatímco DNA zůstává rozpuštěna ve vodné fázi. Přídavek izoamylalkoholu usnadňuje oddělení fází a zabraňuje pěnění. Nakonec se izolovaná DNA promývá v 70% etanolu a rozpouští v alkalickém pufru obsahujícím EDTA.
Moderní postupy extrakce
Moderní metody se zaměřují na snadnější zpracování vzorků:
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
- Extrakce pomocí silikátové pevné fáze: Využívá křemičitých kuliček s velkým povrchem. Přídavkem vysoké koncentrace chaotropních solí dojde k dehydrataci silikátu, na který se následně váže DNA svými fosfátovými skupinami. Kontaminující látky je pak možné snadno odmýt.
- Magnetická separace: DNA se reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem (protilátky, silikát či iontoměnič). Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku a opakovaně promyjí. Tato metoda umožňuje získat DNA ve velmi koncentrované formě.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
tags: #izolace #bakteriální #DNA #principy #metody #postup