Deoxyribonukleová kyselina (DNA) je polymerní molekula nukleotidů vázaných 3´,5´-fosfodiesterovou vazbou, která tvoří dvoušroubovici. Tato molekula nese záporný náboj vlivem fosfátových skupin. Pro získání kvalitní čisté DNA bez příměsí, jako jsou bílkoviny, tuky, soli a jiné nukleové kyseliny, se používají různé metodiky, které se dělí na fenolové a bezfenolové.
Zdroje DNA
DNA lze teoreticky izolovat z jakékoliv živočišné tkáně obsahující živé buňky. U organismů malé velikosti se k izolaci používají i celí jedinci. V tomto případě však samozřejmě hrozí kontaminace parazity, symbionty a potravou. U jednobuněčných živočichů se někdy používá postup, při kterém se nejprve daný jedinec (nebo několik jedinců) rozmnoží a DNA je potom izolována ze všech jedinců najednou.
Zdroje DNA u obratlovců a savců
U obratlovců, jejichž erytrocyty mají jádro, se dá DNA snadno izolovat z krve. Běžně se tak například izoluje DNA i z malých druhů ptáků. U savců je izolace DNA z krve problematičtější a vyžaduje poměrně velké množství (několik mililitrů) krve. U malých savců nebo obojživelníků sice velmi kvalitní DNA získáme z čerstvé ledviny nebo svaloviny, obvykle však vystačíme například s odstřihnutým koncem ocásku nebo částí prstu, takže zvíře nemusíme usmrtit.
Speciální techniky a obtížné zdroje
Při použití speciálních technik je možné izolovat DNA i z takových zdrojů, jako jsou jednotlivé chlupy nebo trus. Tyto techniky však jsou poměrně obtížné a citlivé na kontaminaci. Často lze izolovat DNA i z muzejního materiálu. Dobrým zdrojem DNA jsou hlavně tkáně uchovávané v lihu. Naopak izolace DNA ze vzorků, které přišly do styku s formalínem, často končí neúspěchem.
Izolace z velmi starých vzorků
DNA lze občas získat i z velmi starých vzorků (řádově i desítky tisíc let starých). DNA byla úspěšně izolována z fosilních kostí (např. z neandrtálce) nebo z hmyzu uchovaného v jantaru. Větší naději na úspěch lze očekávat v případě, že kost byla dlouhou dobu v chladném prostředí (například v permafrostu). Při takovýchto izolacích je však třeba postupovat velmi opatrně a pečlivě, neboť riziko kontaminace je veliké. Používají se speciální přetlakové místnosti v budovách, kde nejsou žádné další molekulární laboratoře a pracovníci používají speciální obleky připomínající skafandry, aby maximálně omezili kontaminaci vzorku svou vlastní DNA.
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
Postup izolace DNA
Volba metody extrakce DNA závisí na tom, k čemu ji budeme dále používat. S kvalitně izolovanou DNA se nám však vždy bude pracovat lépe. Pro izolaci se používá celá řada různých protokolů a v poslední době se také často používají komerčně vyráběné soupravy (kity), které však bývají dražší. Podstatou všech procedur je rozpuštění komplexu DNA-protein a extrakce čisté nerozštěpené DNA bez příměsi RNA a bílkovin.
Fenol-chloroformová metoda - „zlatý standard“
Ve většině případů spolehlivě funguje klasická metoda založená na odstranění proteinů pomocí enzymu proteinázy K, extrakce směsí fenolu s chloroformem a precipitaci čistým lihem. Tato technika je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA.
- Homogenizace a lýza buněk: Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K.
- Role proteinázy K: Proteináza K je účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy. Částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny. K detergentu se mohou přidávat ještě enzymy, které napomáhají odbourávání proteinů. EDTA chelatuje Mg2+, které zprostředkují vzájemnou agregaci NK a agregaci NK s proteiny.
- Oddělení denaturovaných proteinů: Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Chloroform rozpouští lipidy a usnadňuje denaturaci proteinů a vzhledem ke své hustotě zlepšuje oddělení organické fáze při centrifugaci od vodné fáze. Právě při pH = 8 přechází NK (DNA i RNA) do vodné fáze, zatímco provádí-li se extakce při pH = 5 - 6, pak ve vodné fázi zůstává jen RNA a DNA přechází do fáze organické. Vyšší pH při extrakci DNA je nutné i jako prevence depurinace. Kvalita extrakce závisí na kvalitě fenolu (nesmí být oxidován). Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny.
- Odstranění RNA: Před izolací čisté DNA je třeba ve vodné fázi odstranit pomocí RNAázy molekuly RNA.
- Vysrážení DNA: Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. ledový 95% ethanol nebo izopropanol) za přítomnosti solí (např. octan sodný, octan amonný, NaCl), které usnadňují oddělení SDS od vzorku NK. Vysrážená DNA se promývá v 70% ethanolu.
- Rozpuštění a skladování: Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA). Získaná DNA se může znovu rozpustit ve vhodném pufru (např. TRIS) s přidáním EDTA asi týden v chladničce při +4°C a dále skladovat při -70°C.
Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.
Modifikace izolace DNA
Snaha maximálně zjednodušit laboratorní protokoly vedla k řadě modifikací izolace DNA. Jednou z nich je nahrazení pufru s proteinázou roztokem obyčejného pracího prášku ve vodě (0,025g/ml). Tkáň se však v tomto případě musí v roztoku prášku dokonale homogenizovat. Při použití kvalitního extrakčního pufru s proteinázou K není tento krok nutný. Další modifikace se používá k izolaci DNA, určené pro její následující amplifikaci pomocí PCR - v tomto případě je extrakční pufr v zásadě shodný s pufrem používaným při této metodě (s tím, že i v tomto případě musíme přidat proteinázu). Při izolaci tkání uchovávaných ve formalínu se v prvních krocích izolace někdy přidává DTT (až ve 100mM koncentraci) nebo se využívají speciální kity.
Bezfenolová metoda
Bezfenolová metoda využívá ke srážení bílkovin místo fenolu koncentrovaný roztok soli (NaCl). Po centrifugaci je NK v supernatantu, bílkoviny v sedimentu. K precipitaci NK ze supernatantu se většinou užívá také ethanol.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
Alternativní metody izolace DNA
- Extrakce na silikátové matrici: Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.
- Magnetická separace: Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).
Kvalita a koncentrace izolované DNA
Koncentraci izolované DNA určíme spektrofotometrem, nebo pomocí elektroforézy v málo koncentrovaném agarozovém gelu a srovnáním se standardy, které naneseme na gel společně se studovaným vzorkem. Izolovanou DNA před použitím obvykle zředíme vodou a zásobní koncentrovaný roztok uchováme v mrazničce.
Kvalita templátové DNA nicméně ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.
Důkaz DNA
Chemikálie a pomůcky: difenylaminové činidlo, kádinka, zkumavka, trojnožka, síťka s keramickou vložkou, kahan, sirky. K roztoku RNA a DNA ve skleněné zkumavce přidáme 1 ml difenylaminového činidla a zkumavka se zahřívá ve vroucí vodní lázni 10 minut.
Polymerázová řetězová reakce (PCR)
PCR je metoda in vitro, tzv. řetězová polymerázová reakce, která nevyžaduje žádný složitý aparát, pouze zvláštní DNA polymerázu a syntetické primery, kterými se zahajuje replikace. Pro zahájení PCR potřebujeme:
- Syntetický DNA primer: krátké oligonukleotidové řetězce, které získáme automatickou syntézou, odpovídají sekvencím na koncích DNA segmentu, který chceme zmnožit.
- DNA polymeráza, tzv. Taq polymeráza.
- Všechny (4) deoxyribonukleozidtrifosfáty (nukleotidy DNA).
Průběh reakce PCR
- Každý cyklus začíná zahřátím směsi na 95°C → denaturace DNA na jednovláknové molekuly.
- Poté ochlazení na 50°C → navázání primeru (annealing) na komplementární sekvence DNA před a za místem, které chceme namnožit (musíme sekvence znát).
- Zvýšení teploty na 72°C → zahájení Taq polymerace od navázaného primeru → vznikají dvě kopie původní DNA.
Po znovu zahřátí reakční směsi na 95°C se cyklus opakuje. Teplota 95°C nedenaturuje Taq polymerázu, není ji třeba znovu dodávat a cykly se mohou mnohokrát opakovat. Po 20-30 cyklech se vytvoří milion až bilion kopií. Jeden cyklus trvá asi 5 minut.
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
Analýza produktu PCR
Produkt PCR se následně analyzuje nejčastěji po obarvení ethidium bromidem gelovou elektroforézou. Přítomnost určitého úseku DNA specifické délky v analyzovaném vzorku poznáme podle přítomnosti jednoho specifického proužku v gelu. Eventuálně amplifikovanou DNA podrobíme štěpení určitým restrikčním enzymem (lze takto zjistit i bodové mutace v cílové DNA).
Další reakce a modifikace PCR
Protože primery při polymeraci jsou inkorporovány do amplifikovaného úseku, lze je na 5’ koncích určitým způsobem modifikovat. Např. pro metodu dot blotů nebo Southern blotů lze primery značit a použít jako hybridizační sondy, nebo se na 5’ konci primeru zavádějí bodové mutace, nebo se přidávají krátké sekvence (inserty) rozpoznávané restrikčními enzymy.
- Invertovaná PCR: Dají se namnožit i úseky s neznámou sekvencí. Neznámý úsek sousedící s úsekem známým se zkrátí restrikční endonukleázou a konce molekuly se spojí do kruhu. Potom se přihybridizují primery ke známé sekvenci v takové orientaci, aby po rozštěpení této známé sekvence jinou restriktázou byl amplifikován právě neznámý úsek.
- RT-PCR (reverzní transkripce PCR): Přepis RNA na DNA.
| Metoda izolace DNA | Princip | Výhody | Nevýhody |
|---|---|---|---|
| Fenol-chloroformová extrakce | Odstranění proteinů proteinázou K, denaturace a separace proteinů fenolem/chloroformem, precipitace DNA alkoholem. | Vysoký výtěžek, vysoká čistota DNA. | Časově náročná, nebezpečné chemikálie, obtížná automatizace, nutnost odstranit zbytky chemikálií. |
| Bezfenolová metoda | Srážení bílkovin koncentrovaným roztokem soli. | Bez použití fenolu. | Nespecifikováno, pravděpodobně nižší čistota nebo výtěžek než fenolová. |
| Extrakce na silikátové matrici | Vazba DNA na silikátový povrch za přítomnosti chaotropních solí, následné promývání. | Relativně jednoduchá, vhodná pro automatizaci. | Nespecifikováno. |
| Magnetická separace | Reverzibilní vazba DNA na magnetické kuličky potažené funkčním povrchem. | Vhodná pro automatizaci a zpracování velkých počtů vzorků, koncentrovanější DNA. | Nespecifikováno. |
tags: #proteinaza #k #izolace #dna #princip