Izolace nukleových kyselin je klíčovým prvním krokem v mnoha molekulárně-genetických technikách. Kvalita templátové DNA nicméně ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.
Obecný postup izolace DNA
Pokud se DNA izoluje z buněk (např. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží. Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z roztoku např. jejím vysolením nebo pomocí jednoduchých alkoholů (etanolu nebo izopropanolu).
Metody izolace nukleových kyselin
Existuje několik základních metod pro izolaci nukleových kyselin, které se liší svými principy, výhodami a nevýhodami.
Fenol-chloroformová extrakce
Fenol-chloroformová deproteinace je nejčastěji používaným denaturačním a precipitačním činidlem. Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA.
Postup fenol-chloroformové extrakce:
Čtěte také: Vlastnosti a využití předpjatého betonu
- Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány.
- Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny.
- Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou.
- Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny.
- Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi.
- Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování).
- Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol). Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu.
- Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).
Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.
Extrakce pomocí silikátové pevné fáze
Extrakce DNA využívá křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.
Magnetická separace
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).
Tabulka srovnání metod izolace DNA:
| Metoda | Výhody | Nevýhody | Automatizace |
|---|---|---|---|
| Fenol-chloroformová extrakce | Vysoký výtěžek, vysoká čistota | Časově náročná, nebezpečné chemikálie, obtížná automatizace, nutnost odstranit zbytky fenolu a chloroformu | Nízká |
| Silikátová extrakce | Relativně jednoduchá | Není uvedeno | Střední (hodí se pro automatizaci) |
| Magnetická separace | Vhodná pro velké počty vzorků, srovnatelné výtěžky a čistota, koncentrovanější DNA | Není uvedeno | Vysoká (vhodná k automatizaci) |
Automatizované izolační systémy: Příklad Magia 12 DSX
Magia 12 DSX je kompaktní systém pro automatickou izolaci nukleových kyselin pomocí magnetických partikulí. Izolace nukleových kyselin probíhá prostřednictvím vazby nukleových kyselin na magnetické partikule a na jejich následném vyvázání do elučního pufru. Předdefinované protokoly, reagencie připravené v jednorázových reagenčních náplních, jednorázový spotřební materiál a plně automatizovaný proces zaručují standardizovaný průběh a vysokou reproducibilitu při extrakci nukleových kyselin z nejrůznějších vstupních materiálů. Magia 12 DSX poskytuje kapacitu zpracování 1 - 12 vzorků současně.
Čtěte také: bezpečná a spolehlivá elektroinstalace
Ovládání a údržba
Ovládání a údržba jsou uživatelsky nenáročné a probíhají prostřednictvím vestavěné klávesnice s LCD displejem a čtečky čárových kódů. Pracovní protokoly jsou naprogramované a uložené v paměti přístroje, nastavení vstupního a elučního objemu je možné přizpůsobit dle požadavků operátora.
Složení izolačních kitů pro Magia 12 DSX
Reagencie jsou připravené v jednorázových reagenčních náplních - odpadá nutnost reagencie uchovávat v reservoárech a kontrolovat jejich množství a stav. Součástí kitů je sada jednorázového spotřebního plastového materiálu, který je k procesu extrakce zapotřebí. Jedná se o reakční komoru, ve které probíhá celý proces izolace nukleových kyselin; dále o propichovací hroty, sloužící k otevření fólie na reagenčních náplních, a o jednorázové špičky s filtrem určené k pipetování a přenášení reagencií. Propichovací hroty a špičky jsou v přístroji uloženy v plastovém držáku, jenž je také součástí kitu.
Čtěte také: Montáž dvířek pro kočky do skla
tags: #izolacni #kit #princip #fungovani