Při studiu mikroorganismů je nezbytné vytvořit kolonii bakterií pocházejících z jedné jediné buňky. Taková populace jedinců vzniklých vegetativním rozmnožením se v mikrobiologii nazývá čistá kultura. Tento proces je klíčový pro přesné studium konkrétních typů bakterií a virů.
Historie a Kochovy postuláty
Izolaci a kultivaci bakterií poprvé systematicky popsal a použil Robert Koch (1843-1910), zakladatel moderní bakteriologie. V roce 1882 publikoval článek o bakterii způsobující tuberkulózu. Koch získal čistou kulturu tak, že jako živné médium použil zpevněné substráty, například agar.
Kochovy postuláty
Kochův asistent Friedrich Loeffler v roce 1884 popsal tři kritéria, za kterých je mikroorganismus možno považovat za původce onemocnění - ta pak dostala označení Kochovy postuláty (později bylo doplněno i čtvrté kritérium). Patogen musí být izolován z nemocného jedince a vypěstován mimo něj v laboratorních podmínkách. Následně musí být „vložen“ do těla pokusného hostitele, který musí onemocnět a vykazovat příznaky stejného onemocnění.
Sám Koch však už v roce 1890 uvedl, že postuláty neplatí pro řadu onemocnění, např. pro tyfus, záškrt či lepru. Na další nedostatky, například na fakt, že některá onemocnění nemusí mít viditelný průběh a symptomy u všech nakažených, začali v průběhu let upozorňovat další vědci.
Omezení Kochových postulátů pro viry
Vztahovaly se však na bakterie, nikoli na viry, které navíc v době vzniku postulátů ještě nebyly objeveny. První virus byl objeven až o několik let později, v 90. letech 19. století. Hlavní problém pokusu aplikovat Kochovy postuláty na viry se skrývá ve třetí podmínce. Koch předpokládá, že zkoumaný mikrob bude schopen se množit ve sterilní kultuře. Viry se však samy rozmnožovat nemohou, jsou závislé na hostitelské buňce - virus do ní vkládá svůj genetický materiál, využívá její proteiny a vytváří tak vlastní replikáty, dokud se buňka nerozloží. Postup, který Koch v postulátech popisuje, při zkoumání virů následovat nelze.
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
Kochovy postuláty jsou dnes považovány za zastaralé a moderní věda je ke klasifikaci virových onemocnění nevyužívá. Koch svá kritéria navíc sepsal v době, kdy viry ještě nebyly objeveny, a sám uznal, že je na řadu onemocnění aplikovat nelze. Nicméně, jako „otec“ moderní bakteriologie, Robert Koch a jeho zkoumání nadále ovlivňují moderní standardy medicíny, přestože se postuláty ve svém původním znění při moderních výzkumech již nevyužívají a jejich naplnění není potřeba k tomu, aby byl prokázán virový původ onemocnění.
Izolace viru SARS-CoV-2
Virus SARS-CoV-2, nový typ koronaviru, který způsobil celosvětovou pandemii, se poprvé objevil v čínském městě Wu-chan v prosinci 2019. Vědci ho poprvé izolovali v Číně v lednu 2020, tehdy ještě pod označením 2019-nCoV. Při izolaci viru se od nakaženého jedince získá čistý vzorek viru. Ten je pak v laboratorních podmínkách umístěn na buněčnou kulturu, kde je kultivován za účelem výzkumu a vývoje vakcín.
Virus byl úspěšně izolován z různých vzorků získaných od pacientů po celém světě, např. v Kanadě, Koreji, Spojených státech, Itálii či Austrálii. Vědcům se podařilo virus SARS-CoV-2 také sekvenovat, tedy „přečíst“ jeho DNA, a to například v Číně či Turecku. Americký Národní institut pro alergie a infekční onemocnění sdílel s veřejností také snímky izolovaného patogenu.
České Ministerstvo zdravotnictví se k izolaci viru SARS-CoV-2 vyjádřilo a zveřejnilo seznam publikací prokazujících existenci tohoto viru. Virus SARS-CoV-2, který způsobuje onemocnění covid-19, byl od svého prvního výskytu v roce 2019 izolován a zkoumán týmy vědců z celého světa. SARS-CoV-2 byl nejen izolován, ale také sekvenován a o jeho podobu se vědci podělili s veřejností.
Význam agaru v mikrobiologii
Před Linou Hesseovou byla klasifikace mikroorganismů natolik komplexní, že Linné zařadil všechny bakterie do řádu Chaos. Kultivační média obsahovala polentu, sražený vaječný bílek, maso, plátky brambor a želatinu. Angelina (Lina) Fanny Hesseová (1850-1934) byla první, kdo navrhl využití extraktu z mořských řas, agaru, jako kultivačního média pro růst a izolaci bakterií.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
Lina Hesseová byla vědecká ilustrátorka a technická asistentka, která zadarmo pracovala pro svého manžela Walthera Hesse, ten byl členem laboratoře Roberta Kocha v Německu. Walther a Koch se pokoušeli o izolaci čistých kultur bakterií, které by vydržely dlouho živé. Lina Hesseová, která pomáhala při přípravě bakteriálních kultivačních médií pro Waltherovy projekty, navrhla využít extrakt z mořských řas jako alternativu za účelem získat stabilní média. Věděla o látce zvané agar-agar od rodinných známých, kteří žili na Jávě v Indonésii. Agar se ukázal jako řešení potíží s kultivacemi! Robert Koch ihned rozpoznal jeho příhodné vlastnosti a využil ho k izolaci slavné bakterie způsobující tuberkulózu.
Vůbec poprvé mohli mikrobiologové kontrolovat bakteriální růst natolik, že bylo možné izolovat čisté bakteriální kmeny. Tento zdánlivě jednoduchý proces se stal klíčovou mikrobiologickou technikou. Pro mikrobiologa je život bez agaru nemyslitelný. To by zařadilo zásadní přínos Liny Hesseové mezi monumentální práce prvních mikrobiologů jako byl Walther Hesse, Julius Richard Petri a Robert Koch.
Příprava živných půd a sterilizace
Existuje celá škála živných půd pro mikroorganismy. Všechny však musí mít obecné vlastnosti, mezi které patří zdroj energie (též vodíku a elektronů), zdroje základních biogenních prvků (uhlíku, dusíku, ostatních biogenních prvků) a akceptor elektronů.
Příprava masopeptonového agaru
Masopeptonový bujon (resp. jeho pevná forma masopeptonový agar) je klasické živné médium pro bakterie.
- Masový extrakt
- Pepton
- NaCl
- Agarová řasa
- Destilovaná voda
NaCl, masový extrakt a pepton se rozpustí v horké vodě a roztok se následně cca 10 minut vaří. Po ochlazení se doporučuje kontrola pH a případně její upravený na hodnotu pH 7,2 - 7,4.
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
Sterilizace
Sterilizace je zahubení všeho živého v daném prostředí (např. v baňce, zkumavce). Systém musí být při sterilizaci ovšem uzavřen tak (vatovou zátkou), aby po skončení sterilizace nedošlo k nové kontaminaci z nesterilního okolí. Vatovými zátkami se uzavírají nádoby obsahující sterilizované živné půdy a čisté kultury naočkované na živných půdách. Zajišťují průchod dýchacích plynů a zároveň zabraňují průniku jiných bakterií. Vytváří se z napříč složeného, pevně srolovaného proužku buničité vaty, širokého ve shodě s požadovanou výškou zátky.
Sterilizaci je možno provádět několika způsoby, např. žíháním v plameni, suchým teplem (sterilizace se provádí v horkovzdušných sterilizátorech 1 hodinu při 160 °C), vodní parou (přičemž sterilizace horkou vodní parou je účinnější než sterilizace suchým teplem). Sterilizujeme tak všechny vodné roztoky a s vodou se mísící kapaliny. Můžeme tak sterilizovat i suché sklo (pipety, misky) i prázdné nádoby uzavřené vatovou zátkou.
Sterilizaci nádobí a živných půd lze samozřejmě provádět i v tlakovém hrnci za dosažení stejných výsledků. Pouze manipulace a prostorové omezení hovoří ve prospěch použití autoklávu.
Očkování a kultivace bakterií
Očkování je přenesení části populace čisté kultury (inokula) do jiné nádoby s živným médiem. Mikrobiologická klička musí být před použitím vypálena.
Postup očkování na agarové půdy
- Ze šikmo nakloněné baňky vyjmeme vatovou zátku, krátce v plameni ožehneme hrdlo baňky s tekutou agarovou půdou držené dnem v dlani pravé ruky, ožehneme též vatovou zátku.
- Jednou rukou opatrně zdvihneme víčko sterilní Petriho misky a vlijeme do ní takové množství agarové půdy, aby vznikla vrstva 3-5 mm tlustá. Nesmí dojít k potřísnění okraje misky.
- Po zatuhnutí očkujeme na agarové půdy vzorky, ze kterých chceme kultivovat bakterie. Lze doporučit kultivaci z půdy, ze vzduchu, z otisku předmětu nebo kašle.
- Po naočkování do živného média necháme bakterie cca 3-5 dní pomnožit.
Příprava čistých kultur z bakteriálních shluků
Z bakteriálních shluků připravíme čisté kultury tak, že z jednotlivých kupek bakteriálních kolonií přenášíme mikrobiologickou kličkou biomasu na čisté plotny v podobě krátkých čar, přes které po obvodu vedeme křížem jiné čáry (opakuje asi 3×).
Počítání bakterií
Pro počítání bakterií je nutno kulturu bakterií naředit. Každé ředění ideálně pipetujeme na 2 mírně vyschlé plotny v množství 0,1 ml. Suspenzi roztíráme na Petriho misce sterilní zahnutou skleněnou tyčinkou („hokejkou“). Po 48 hodinách spočítáme kolonie, přičemž nás zajímá ředění, které dává 20 až 200 kolonií na misce.
Barvení bakterií a mikroskopie
Bakteriální buňky nejsou v optickém mikroskopu téměř viditelné, a proto je barvíme. Každé organické barvivo se skládá ze dvou funkčních částí - chromoforu a auxochromu. Chromofor (např. skupina -NO2) uděluje molekule barevnost, auxochrom (např. skupina -OH) podporuje vazbu barviva na vlákno.
Barviva jsou obecně dvojího druhu: kyselé barvivo disociuje tak, že barevná část molekuly je aniontem, bazické barvivo tak, že barevná část molekuly je kationtem. Bazické nebo bazofilní barvivo pak barví kyselé struktury v buňce (např. jádro), zatímco kyselé barvivo bazické struktury. Gramovo barvení je diferenciální barvení.
Příprava preparátu pro barvení
- Mikrobiologickou kličkou naneseme z plotny malé množství bakteriální biomasy do připravené kapky vody a rozmícháme na sklíčku v jemně zakalenou suspenzi.
- Kličkou rozetřeme suspenzi do plochy tak, aby vznikl tenký souvislý film. Ten necháme bez zahřívání na vzduchu uschnout.
- Posléze fixujeme protažením plamenem kahanu a barvíme dle Grama.
Postup Gramova barvení
Připravený nafixovaný preparát barvíme nejdříve po dobu 90 s krystalovou violetí tak, že na preparát na podložním skle nakapeme barvivo. I po tomto barvení oplachujeme, sušíme filtračním papírem a posléze pozorujeme olejovou imerzí.
Mikroskopie
Objektiv vytváří převrácený a zvětšený obraz předmětu. Jeho ohnisková vzdálenost kolísá od 20 mm do 1,5 mm. Numerická apertura objektivu je charakteristická hodnota daná konstrukcí objektivu a je uvedena, stejně jako zvětšení, přímo na plášti objektivu. Hloubka ostrosti objektivu je nepřímo úměrná numerické apertuře. Čím silnější objektiv, tím menší hloubka ostrosti. Okulár dále zvětšuje obraz vytvořený objektivem, a to podle konstrukce 5x až 20x. Celkové zvětšení mikroskopu je dáno součinem vlastních zvětšení objektivu a okuláru. Bakterie se dobře pozorují pomocí mikroskopu s fázovým kontrastem.
tags: #koch #izolace #ciste #kultury