Předkládaná práce se zabývá izolací DNA pomocí různých metod, včetně izolace komerčním kitem, a vlivem izolace na identifikaci DNA pomocí molekulárně biologických metod. V experimentální části byly zkoumány tři metody izolace DNA: metoda fenolové extrakce, izolace magnetickými částicemi a izolace komerčním kitem. DNA byla izolovaná ze tří doplňků stravy, a to Biopron 9 premium, Linex forte a GS Laktobacily forte 21. Čistota a koncentrace izolované DNA byla zjištěna spektrofotometricky.
Co je komerční kit pro vlastní izolaci DNA?
Komerční kity pro izolaci DNA představují sadu reagencií a protokolů navržených pro efektivní a spolehlivou extrakci DNA z různých typů vzorků. Tyto kity jsou často optimalizovány pro konkrétní aplikace, jako je příprava knihoven pro sekvenování nové generace (NGS) nebo genotypizaci pomocí PCR.
Příklady komerčních kitů a jejich použití
- Pro purifikaci vysoce kvalitní gDNA z různých zdrojů se používají specializované komerční kity, například Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Cat. #K0721/2), GeneJET Viral DNA a RNA purification Kit (Cat. #K0821), nebo MagJET Genomic DNA Kit (Cat. #K2721/2), MagJET Viral DNA a RNA Kit (Cat. #K2821).
- DEP-25 (DNA Extrakce pro PCR do 25 min) DNA Extraction Kit je dvousložková souprava pro extrakci genomové DNA různého původu. Hlavní výhodou soupravy je, že extrakce pomocí DEP-25 je provedena rychle a v jedné zkumavce. DNA z různých buněk a tkání může být připravena do 25 min a nevyžaduje časově náročné enzymatické opracování, purifikaci na koloně nebo fenol/chloroformovou extrakci. DEP-25 je složena ze dvou složek, START-Blue a STOP. START-Blue obsahuje barevný indikátor pro vizuální indikaci správnosti roztoku. DNA izolovaná pomocí DEP-25 je využitelná při genotypizaci pomocí metody PCR a PCR v reálném čase (qPCR).
Princip fungování "DNA kitů"
Funkce DNA kitů se liší v závislosti na konkrétním produktu, ale obecně zahrnují kroky pro lyzi buněk, odstranění kontaminantů a izolaci čisté DNA. Například při přípravě knihovny pro sekvenování se často kombinuje úprava konců a připojení adaptérů do jednoduché metody v jediné zkumavce. V prvotní fázi jsou upraveny konce fragmentované DNA, přičemž se zatupí 5' - a 3' - přesahy, fosforylují se 5' - konce a jeden dA přesah je přidán na 3' - konec každého fragmentu.
Extrakce DNA pomocí DEP-25 zahrnuje 3 jednoduché kroky a trvá ~25 minut:
- Lyze vzorku s roztokem START-Blue.
- Inaktivace enzymů a vysrážení nečistot pomocí roztoku STOP.
- Získání čisté DNA v supernatant, připravené pro PCR.
Kvalita a také množství výchozí DNA velmi ovlivní celkovou úspěšnost přípravy DNA knihovny a výsledky sekvenování. Zbytkové stopy kontaminujících proteinů, organických rozpouštědel a jejich solí mohou degradovat DNA nebo snižovat aktivitu enzymů, které jsou nezbytné pro efektivní přípravu DNA knihovny. Protokol pro konstrukci knihovny vyžaduje fragmentovanou DNA získanou jakoukoliv fyzikální metodou, například za pomoci ultrazvuku nebo nebulizace. Kvalitu fragmentované DNA vždy ověřte elektroforézou v agarózovém gelu a také pomocí Agilent 2100 Bioanalyzer®.
Čtěte také: Návod na obklad kuchyně s motivem
Příprava NGS knihovny s použitím komerčního kitu
Pokud se komerční kit zkombinuje s amplifikačním protokolem, NGS knihovnu lze zkonstruovat z pouhých 5ng až 1ug DNA. Největší výhodou tohoto protokolu je, že spojuje úpravu konců a připojení adaptérů do jednoduché metody, kterou lze provádět v jedné jediné zkumavce.
Postup přípravy knihovny (bez amplifikace)
V tomto návodu se dozvíte, jak zkonstruovat knihovnu bez amplifikace s použitím 500ng - 1ug vysoce kvalitní fragmentované DNA.
- Rozmrazte reakční složky na ledě, promíchejte a krátce centrifugujte.
- Inkubujte reakční směs v termocykleru (teplota víka 100 °C) po dobu 5 minut při teplotě 20°C, 10 minut při 72°C, a nakonec udržujte reakci při teplotě 4°C. Udržujte směs na ledu.
- Inkubujte reakční směsi při pokojové teplotě (20°C - 25°C) po dobu 5 minut.
Přečištění a výběr velikosti DNA knihovny
- Knihovny připravené z 50ng až 1ug výchozí DNA mohou být přečištěny kitem MagJET NGS Cleanup a Size Selection (Cat. #K2821), který umožňuje výběr čisté DNA knihovny přímo připravené pro sekvenování v rámci požadované délky čtení. Tento protokol zajistí odstranění adaptérů. Po výběru velikosti může být DNA použita přímo pro sekvenování bez dalšího kroku čištění.
- U knihoven připravených z menšího množství DNA než 50ng (5ng - 50ng) se doporučuje odstranění adaptérů a přečištění pomocí MagJET NGS Cleanup a Size Selection Kit (Cat. #K2821).
- Přečistěte DNA knihovnu s připojenými adaptéry pomocí MagJET NGS Cleanup a Size Selection Kit (Cat. #K2821) (Protokol přečištění) nebo GeneJET NGS Cleanup Kit (Cat. #K0851) (Protokol přečištění).
Doporučená střední velikost DNA knihovny pro různé délky čtení při sekvenování je uvedena v tabulce 2 níže:
| Délka čtení (páry bází) | Doporučená střední velikost DNA knihovny (bp) |
|---|---|
| 50 | 150-250 |
| 100 | 200-300 |
| 150 | 250-350 |
| 300 | 400-600 |
Gelová elektroforéza a extrakce
Pro izolaci DNA knihovny o požadované velikosti z gelu se používá Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction a DNA Cleanup Micro Kit (Cat. #K0831/2). Je důležité si uvědomit, že jedna kolonka je určena pro izolaci DNA z ~ 200mg gelu. Pokud je vyříznutý gel větší než 200mg, měl by být rozdělen do dvou kolonek podle instrukcí v manuálu. Po eluci DNA z každé kolonky pomocí 11ul elučního pufru se frakce spojí do finálního objemu 20ul.
Amplifikace DNA knihovny
Pokud je objem 20ul, doporučuje se použít adaptér-ligovanou DNA připravenou z méně než 50ng výchozí DNA. Přidejte 10 ul přečištěné adaptér-ligované DNA knihovny do čisté tenkostěnné 0,2 ml zkumavky a přidejte další reagencie v daném pořadí. Přečistěte amplifikovanou DNA knihovnu pomocí kitů Thermo Scientific MagJET NGS Size Selection a Cleanup Kit (Protokol pro přečištění) nebo Thermo Scientific GeneJET NGS Cleanup Kit (postupujte podle protokolu pro přečištění). Proveďte eluci DNA knihovny do 22ul elučního pufru.
Čtěte také: Použití betonových tvárnic s izolací
Kontrola kvality a kvantifikace
Doporučuje se provádět qPCR kvantifikaci DNA knihoven bez amplifikace a amplifikovaných DNA knihoven před vlastním sekvenováním. Dále zkontrolujte distribuci velikostí fragmentů připravené DNA knihovny tak, že provedete analýzy na přístroji Agilent 2100 Bioanalyzer pomocí High Sensitivity DNA Kit. Neamplifikované DNA knihovny mohou být analyzovány neředěné. Odhadovaná velikost fragmentů u neamplifikované knihovny je podstatně větší (odchylka do ~ 60-100 nt). Atypická migrace fragmentů na čipu je způsobena strukturou Illumina adaptérů ligovaných k oběma koncům DNA fragmentů.
Čtěte také: Výhody tepelně izolačních cihel
tags: #co #je #komerční #kit #pro #vlastní