Izolace z živné půdy je klíčovým procesem v mikrobiologii, který umožňuje studium a identifikaci mikroorganismů. Živné půdy jsou substráty poskytující vhodné životní podmínky pro růst mikroorganismů.
Typy živných půd
Existuje několik typů živných půd, které se liší svým složením a účelem:
Tekuté půdy
- Tekuté půdy neobsahují žádné ztužující látky, proto jsou po celou dobu kultivace mikroorganismů tekuté.
- Mohou být definovanou směsí organických a anorganických sloučenin nebo hydrolyzáty některých přírodních materiálů.
- Používají se k pomnožení mikroorganismů, k přípravě čistých kultur, k oživení mikrobiálních kultur i k dalším účelům.
- Růst se projeví zákalem, sedimentem nebo blankou na povrchu média. Růstové typy se mohou kombinovat, např. kmen roste v zákalu a současně vytváří sediment.
Pevné půdy
- Pevné půdy jsou nejrozšířenějším typem médií, která vždy obsahují ztužující složku, nejčastěji agar v koncentraci 15-30 g na 1 litr média. Agar je polysacharid získávaný z mořských řas rodu Gelidium (rosolenka), dnes také z dalších druhů (Gracilaria, Ptyllophora, Euchlema, Ceramium).
Speciální typy půd
- Obohacené půdy: Používají se ke kultivaci růstově náročnějších bakterií, které potřebují speciální růstové faktory. Jsou bohaté na živiny a růstové faktory. Mohou být obohacené například o aminokyseliny, vitaminy, cukry apod. Typickým příkladem je krevní agar obohacený o růstový faktor hemin, který je nezbytný např. pro Haemophilus influenzae.
- Selektivní půdy: Na selektivních půdách rostou jen určité organismy a používají se tedy, pokud chceme daný druh izolovat. Toho dosahujeme buď přidáním látek, které mají baktericidní účinky na určitý druh, anebo naopak že médium bude chudé na určité látky (např. daná aminokyselina) nezbytné pro růst nežádoucích organismů. Příkladem je selektivní půda pro korynebakterie, které redukují teluričitan na telur a to se následně projeví zbarvením půdy do šeda (popř. kolem jednotlivých kolonií korynebakterií se tvoří šedočerný zákal).
- Diagnostické půdy: Tyto půdy se používají pro rozlišení více druhů organismu nacházejících se na jednom médiu. Toho je docíleno většinou rozdílným zabarvením jednotlivých kolonií, což je způsobeno např. rozdílným metabolismem určité látky, jejíž produkty pak reagují s indikátorem v půdě. Umožňují jednotlivé mikrobiální druhy od sebe rozlišit.
- Selektivně-diagnostické půdy: Jsou kombinací selektivních a diagnostických půd. Obsahují inhibitory a indikátory a jsou proto specifičtější než předchozí dvě.
- Transportní půdy: Jsou určeny k přepravě vzorku do laboratoře. Obsahují minimum živin, aby nedošlo k přemnožení a zkreslení kvantity mikroorganismu ve vzorku.
Kromě klasických půd jsou k dispozici i chromogenní média. Všechny chromogenní půdy pro stanovení bakterií jsou v souladu s ISO 16140, tj. jsou schválenými alternativami ke stávajícím metodám detekce. Chromogenní media obsahují barevný substrát, který je zcela specifický k dané bakterii, pro kterou je medium určeno. Příkladem je chromogenní médium pro detekci bakterie Staphylococcus aureus, jehož základem je médium dle Baird-Parkera. Pro zvýšení selektivity je přidáván vaječný žloutek (identifikace plasmakoagulasa pozitivních stafylokoků). Médium je validováno dle ISO 16140. Dalším příkladem je chromogenní médium pro stanovení bakterie E. coli a ostatních koliformních bakterií v potravinách i vodách s odečtem výsledků do 24 hodin, kde další konfirmace není nutná. Médium využívá enzymů produkovaných E. coli. Hledané bakterie je možné stanovit jednak klasickými médii, ale i médii chromogenními, díky kterým se doba analýzy významně zkracuje.
Složení těchto medií je již historicky zakotveno v mezinárodních ISO normách. Veškeré nabízené půdy svým složením jim odpovídají, což je potvrzováno dodávaným certifikátem kvality.
Očkování mikroorganismů
Očkování (inokulace) mikroorganismů je aseptické přenášení mikroorganismů do nového sterilního živného prostředí a to tak, aby do nově zakládané mikrobiální kultury nevnikly žádné cizí mikroorganismy. Přenesené mikrobiální buňky se nazývají inokulum. Při očkování musíme dodržovat naprosto aseptické podmínky, očkujeme v prostředí zbaveném mikroorganismů, např. v blízkosti plamene, nejlépe ve sterilním očkovacím boxu. Při očkování otevíráme kultivační nádoby, v nichž máme živnou půdu a do nichž budeme mikroorganismy očkovat, na co nejkratší dobu. Pracujeme co nejrychleji a nejsoustředěněji. Očkujeme nejčastěji očkovací kličkou nebo jehlou, kterou před očkováním důkladně vyžíháme v plamenu. Dbáme, abychom očkovali teprve tehdy, až bude klička náležitě vychladlá. Kličku po očkování vždy zase důkladně ožehneme (vypálíme), abychom neroznášeli mikroorganismy po okolí. Očkujeme-li tekutý materiál, pak někdy místo očkovacích kliček používáme sterilní skleněné pipety nebo automatické pipety.
Čtěte také: Jak na zateplení půdy s volnou izolací?
Očkování na pevné půdy
Očkování na pevné půdy provádíme k těmto účelům:
- K izolaci mikroorganismů a přípravě čistých mikrobiálních kultur.
- K zakládání kultur, které použijeme k důkazu, rozlišení a počítání individuí a druhů.
- K získání charakteristických kolonií, které slouží k diagnostice.
- K přípravě trvalých kultur a kultur zasílaných jiným laboratořím apod.
Očkování zaléváním do tuhých agarových půd - očkování přelivem
Agarové půdy můžeme očkovat zaléváním čili přelivem. Objem inokula 1 ml vhodně naředěného vzorku (mikrobiální suspenze) přeneseme sterilní pipetou do prázdné, řádně označené sterilní Petriho misky. Každé ředění pipetujeme paralelně do dvou Petriho misek, přičemž při očkování více ředění, musí být každé ředění naočkováno novou sterilní pipetou. Co nejdříve, nejpozději do 15 minut, nalijeme do misek potřebné množství rozehřáté a na 45 °C vytemperované agarové půdy, vhodné pro růst kultivovaných mikroorganismů. Vrstva živné půdy v Petriho misce má mít tloušťku asi 3 - 5 mm, což odpovídá přibližně 15 - 20 ml živné půdy. Ihned po nalití promísíme živnou půdu se vzorkem (s mikrobiální suspenzí) krouživými pohyby (po a proti směru hodinových ručiček) Petriho miskou položenou na stůl a necháme utuhnout ve vodorovné poloze. Při promíchávání musíme dát pozor, aby živná půda nevytekla a nepotřísnila víčko misky. Po ztuhnutí dáme v indikovaných případech naočkovanou půdu dosušit do sušárny na 30 minut při 50 °C tak, že otevřenou plotnu i víčko klademe dnem vzhůru.
Očkování na pevné půdy na Petriho miskách křížovým roztěrem
Potřebujeme-li získat izolované kolonie nebo čistou kulturu, použijeme křížový roztěr. Očkování spočívá v postupném zřeďování původního vzorku tak, aby na konci roztěru vyrůstaly jednotlivé, dostatečně vzdálené kolonie. Vyžíhanou očkovací kličkou odebereme inokulum, které přeneseme na plotnu s agarovou živnou půdou. Kličku vyžíháme a pokračujeme ve zřeďování kultury pomocí rovných nátěrů, mezi jednotlivými kroky kličku vždy vyžíháme. Existuje více druhů nátěrů na povrch živné půdy v Petriho misce. Do Petriho misky nalijeme agarovou živnou půdu a necháme ji ztuhnout, na povrch půdy naočkujeme sterilní pipetou nejčastěji 0,1 ml vhodně naředěného mikrobiálního vzorku (mikrobiální suspenze). Inokulum rozetřeme sterilní zahnutou skleněnou tyčinkou (do tvaru hokejky) rovnoměrně na povrch celé plochy Petriho misky. Naočkovanou živnou půdu necháme oschnout v termostatu stejným způsobem jako při očkování půd zaléváním (přelivem).
Očkování na pevné půdy ve zkumavkách
Pevné půdy ve zkumavkách můžeme očkovat vpichem nebo očkujeme na tzv. šikmý agar.
Očkování na šikmý agar
Vlastní očkování na šikmý agar provedeme tak, že do levé ruky vezmeme rovnoběžně nebo zkříženě dvě zkumavky, jednu s kulturou a druhou s čerstvou živnou půdou, na kterou budeme očkovat. V blízkosti plamene ožehneme očkovací kličku. Když vychladne, vyjmeme zátky ze zkumavek a přidržujeme je v pravé ruce spolu s očkovací kličkou. Očkovací kličku zasuneme do zkumavky s kulturou tak, aby se nedotýkala jejich stěn. Pak nabereme na kličku trochu nátěru kultury a přeneseme ji zase v blízkosti plamene do druhé zkumavky. Ve zkumavce s novou pevnou živnou půdou potřeme lehce, vlnovitě povrch živné půdy. Použitou očkovací kličku vyžíháme. Než uzavřeme zkumavky, ožehneme rychle jejich horní okraje a potom zkumavky uzavřeme vatovými nebo kovovými zátkami, které rovněž ožehneme. Pokud si nejsme technikou práce jisti, můžeme postupovat tak, že nejdříve asepticky odebereme vzorek ze zkumavky, kterou následně odložíme do stojánku a pak teprve očkujeme druhou zkumavku. Vše za dodržení podmínek aseptické práce. Očkování provádíme při kultivaci anaerobních mikroorganismů a pro některé zvláštní účely, např. ke sledování růstu, vztahu kultury ke kyslíku, ztekucování želatiny, tvorby sirovodíku nebo pro uchovávání kultur. Při očkování vpichujeme kulturu rovnou očkovací jehlou do svislé tuhé živné půdy (vysokého sloupce agaru) asi 0,5 cm nad dno zkumavky. Tuhá živná půda dosahuje asi do dvou třetin zkumavky.
Čtěte také: Komfort bydlení s izolovanou půdou
Očkování do tekutých půd
K očkování můžeme zvolit pipetu, při očkování z tekutého média, nebo kličku při očkování z tekutého i pevného média. Kultura se nabere vyžíhanou a zchlazenou kličkou. Asepticky se otevře zkumavka, okraje se ožehnou plamenem a klička se ponoří do média. Inokulum uvolňujeme do média otíráním kličky o stěnu pod hladinou kapaliny a pak dobře rozmícháme. Při očkování mikroorganismů z tekutého média můžeme použít kličku, kdy tekutinu nabereme do jejího očka. Při očkování většího nebo určitého objemu tekutého inokula použijeme sterilní pipety. Zkumavku s médiem otevíráme a uzavíráme asepticky, použitá klička se vysterilizuje v plamenu.
Očkování do tekutých půd - metoda MPN (Most Probable Number)
Způsob očkování, který se používá při stanovení nejpravděpodobnějšího počtu mikroorganismů, tzv. metoda MPN. Metoda se využívá při stanovení počtu mikroorganismů ve vzorcích, kde se očekává jejich nízký počet. Sada zkumavek naplněných 10 ml příslušného živného média se zaočkuje 1 ml vzorku nebo daného ředění vzorku. Podle množství zkumavek v každé sadě rozlišujeme test třízkumavkový, pětizkumavkový nebo desetizkumavkový. Po kultivaci se vyhodnotí počty zkumavek s pozitivní reakcí, která se projeví viditelným růstem bakterií (zákal, sediment, změna barvy média, tvorba plynu apod.). Z pozitivních výsledků se sestaví kód a z příslušných statistických tabulek se odečte množství mikroorganismů. Výsledkem je stanovení pravděpodobného počtu mikroorganismů v 1 ml nebo 1 g vzorku.
Detekce a kvantifikace mikroorganismů
Kromě kultivačních metod existují i rychlé mikrobiologické metody pro detekci a kvantifikaci bakterií. Tyto metody jsou zásadní pro sledování a hodnocení mikrobiologické kvality, zejména v potravinářských provozech.
Rychlé metody detekce
- NEMIS N-light testy: Jsou rychlou a spolehlivou metodou bez použití laboratoře. Detekují pouze živé patogeny a jsou spolehlivé pro testování patogenů v potravinářském provozu.
- CytoQuant®: Je první mobilní cytometr, který okamžitě ověří účinnost čisticích postupů ve vaší provozovně. Kvantifikuje bakterie a rezidua do 30 sekund. CytoQuant je praktické ruční zařízení, které přináší výhody a efektivitu průtokové cytometrie.
- Luminometry na principu ATP: Jsou velmi dobrou a rychlou alternativou pro monitoring hygienicko-sanitačních opatření. Nabízejí univerzální kontrolu HACCP systému pomocí řady možných aplikací. Systém novaLUM II dokáže během pěti sekund detekovat i nejnižší úroveň kontaminace ATP. Ke kontrole jsou používány speciální detekční stěrové tampóny následně vyhodnocované v kontrolní cele. Určeny jsou ke kontrole stěrů z povrchů či technologií, přečištěných potrubních tras, výplachových vod, atd. Uplatnění nacházejí i při kontrole alergenů, verifikaci pasterace nebo screening pesticidů.
- PCR (Polymerázová řetězová reakce): PCR je založené na principech molekulární biologie, tzn. detekce molekuly DNA dané bakterie. Tímto způsobem je možné detekovat bakterie do 24 hodin od pomnožení vzorku. Molekula DNA bakterie je detekčním kitem rozpoznána, dojde k jejímu označení fluorogenní látkou a následně k odečtu signálu. Díky tomu je možná i kvantifikace. Gene-Up je moderní a spolehlivý analyzátor alimentárních patogenů, který využívá analytickou metodu založenou na RT-PCR. Metodika Gene-Up je díky své spolehlivosti a rychlosti vhodná jak do laboratoří v potravinářské výrobě tak i do kontrolních a dohledových laboratořích státní správy.
- Otiskové destičky HygieneChek PLUS: Jsou snadno použitelné, spolehlivé a ekonomické mikrobiologické systémy. Plocha destičky detekuje různé mikroorganismy, které se běžně vyskytují ve vodě, potravinách, kosmetice, léčivých přípravcích a prostředí. Vzorky lze odebírat přímo z kapalin a povrchů.
- RapidChek Total Protein: Je kolorimetrický test určený ke kontrole povrchů na přítomnost zbytku bílkovin.
Příprava vzorků a médií
Pro zajištění spolehlivých výsledků je klíčová správná příprava vzorků a médií.
- Pro detekci a stanovení počtu bakterií Legionella pneumophila a Legionella spp. je možné využít kultivační metody a stejně tak metody rychlé mikrobiologie.
- Pro kultivační stanovení bakterií rodu Legionella spp. nabízíme média dle ISO 11731, tj. standardní médium GVPC s následnou kultivací na BCYE či krevním agaru. Serotypizace se provádí latexovým testem (L. pneumophila SG1, SG2-15 a L. anisa). Novinkou je alternativní médium pro vysoce kontaminované vody - agar MWY.
- Rychlou metodou stanovení bakterií Legionella spp. a L. pneumophila přímo na místě je detekce za 30 sekund.
Tyto výrobky mají obecně nízký celkový počet mikroorganismů. Zkoušky na přítomnost specifikovaných mikroorganismů se provádějí v tekuté půdě D a s peptonem o pH 7,0, která se použije jako tekutá půda, nebo se vloží do 100 ml tekuté půdy A a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C.
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
Kvantitativní stanovení se provádí zředěním zkoušeného výrobku. Z tabulky 2.6.13-1 se stanoví pravděpodobný počet bakterií.
Pro stanovení Escherichia coli se zkoušený výrobek vloží do 100 ml pomnožovací půdy E a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potvrzení se provede vhodnými biochemickými zkouškami, jako je tvorba indolu.
Při detekci Salmonella sp. je třeba mít na paměti, že laktóza negativní kmeny budou bílé.
Pro Clostridium se provede vyočkování na půdu Q bez gentamicinu a inkubuje se za aerobních a anaerobních podmínek 48 h při 35 °C až 37 °C. Nejpravděpodobnější počet Cl. perfringens se stanoví.
Při přípravě živných půd je důležité upravit pH. Například pH tekuté půdy A by se mělo upravit tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Pro agarovou půdu B by pH mělo být 7,3 ± 0,2. Pro agarovou půdu C je ideální pH 5,6 ± 0,2. U tekuté půdy D je doporučené pH 7,0, přednostně před sterilizací. Pro půdu E je vhodné pH 7,3 ± 0,2 po zahřátí. Tekutá půda F by měla mít pH 7,4 ± 0,2 po zahřátí. Agarová půda G vyžaduje pH 7,1 ± 0,2 po sterilizaci. Agarová půda J má pH 7,2 ± 0,2 po zahřátí. Agarová půda K má mít pH 7,4 ± 0,2 po zahřátí. A pro agarovou půdu M je ideální pH 6,8 ± 0,2 po sterilizaci.
Pro stanovení sterility se půda sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C. Pro uchování při 4 °C je třeba půdu po sterilizaci opět zahřát 5 min ve vodní lázni a ochladit. Používají se různé pevné půdy, vybrané z agarové půdy J, agarové půdy K a agarové půdy L. Inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C.
Pro důkaz bakterií se zkoušený výrobek vloží do 100 ml tekuté půdy A a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Poté se pro dosažení selektivní izolace provede vyočkování na agarovou půdu F a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C.
Pokud jde o detekci stafylokoků, typické kolonie na agarové půdě M, obklopené růžovou nebo červenou zónou, indikují přítomnost S. aureus.
Při zkoušce na přítomnost Pseudomonas aeruginosa se použije sterilní membránový filtr, který se vloží do 100 ml tekuté půdy A a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C.
Pro test na Clostridium se použije tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. Zkumavky nebo jiné vhodné nádoby s malou Durhamovou zkumavkou se promíchají a inkubují se 24 h až 48 h při 45,5 °C až 46,5 °C.
Zkoušky na Bacillus species zahrnují test na katalasovou reakci s peroxidem vodíku zředěného RS. Růst kolonií gramnegativních tyčinek indikuje možnou přítomnost Escherichia coli, což se potvrdí vhodnými biochemickými zkouškami, jako je tvorba indolu.
Všechny uvedené zkoušky se provedou nejméně u každé šarže dehydrované živné půdy. Do zkušebních postupů, které používají selektivní půdy, se přidá nepatogenní salmonela, např. 1 ml (100 mikroorganismů od každého kmene) jako inokulum ve zkouškách na S. aureus, Ps. aeruginosa, E. coli za přítomnosti i nepřítomnosti zkoušeného výrobku.
Pro kontrolu anaerobních podmínek se odebere sterilní membránový filtr, který se vloží do 100 ml živné půdy P a inkubuje se 18 h až 24 h při 43 °C až 45 °C.
Pro zajištění optimálních podmínek se provádí inkubace 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Před použitím se půda zahřívá 5 min ve vodní lázni a ochladí se.
Příklady složení živných půd a jejich úpravy
Zde je přehled některých živných půd a jejich specifických vlastností:
| Název půdy | Úprava pH po sterilizaci/zahřátí | Poznámky |
|---|---|---|
| Tekutá půda A | 7,3 ± 0,2 | Inkubace 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. |
| Agarová půda B | 7,3 ± 0,2 | |
| Agarová půda C | 5,6 ± 0,2 | |
| Tekutá půda D | 7,0 ± 0,2 | Přednostně před sterilizací. |
| Pomnožovací půda E | 7,3 ± 0,2 | Po zahřátí. |
| Agarová půda F | 7,4 ± 0,2 | Po zahřátí. |
| Agarová půda G | 7,1 ± 0,2 | |
| Agarová půda J | 7,2 ± 0,2 | Po zahřátí. |
| Agarová půda K | 7,4 ± 0,2 | Po zahřátí. |
| Agarová půda M | 6,8 ± 0,2 | |
| Tekutá půda P | 6,8 ± 0,2 |
Pro stanovení Streptococcus mutans v tekutém mediu se použije tekutá půda D s polysorbátem 80 nebo lecitinem. Kolonie gramnegativních tyčinek obklopené růžovou nebo červenou zónou indikují přítomnost S. aureus. Živná půda s gentamicinem se inkubuje za anaerobních podmínek 48 h při 35 °C až 37 °C.
Při detekci sirovodíku se kontroluje, zda netvoří sirovodík. Typické kolonie gramnegativních tyčinek na agarové půdě s fenolovou červení mění barvu z červené na žlutou a obvykle též ke tvorbě plynu v agaru. Potvrzení se provede sérologickými zkouškami. Tyto zkoušky nezachytí subletálně poškozené mikroorganismy. Inkubace se provádí 18 h až 24 h při 41 °C až 43 °C.
tags: #izolace #z #zivne #pudy #co #to