Izolace plasmidové DNA je v mikrobiologii důležitou a často využívanou metodou. Samotné izolaci plazmidů předchází příprava bakteriálních kompetentních buněk a amplifikace plasmidů. V této práci jsou plazmidy CHR2, ASAP1, ASAP-3, ASAP-5 a Kir2.1 nejprve amplifikovány v bakteriích E.Coli kmenu DH5 a poté izolovány.
Základní principy izolace DNA
Pokud se DNA izoluje z buněk, je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kvalita templátové DNA nicméně ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.
Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží. Nejčastěji používaným denaturačním a precipitačním činidlem bývá fenol. Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi. Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z roztoku např. jejím vysolením nebo pomocí jednoduchých alkoholů (etanolu nebo izopropanolu). Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).
Metody izolace plazmidové DNA
K izolaci plazmidové DNA se využívá různých metod, které nabízejí odlišné výhody a nevýhody.
Fenol-chloroformová extrakce: "Zlatý standard"
Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny. Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny. Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka. Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. K určení správnosti izolace slouží gelová elektroforéza a transfekce do buněčné linie HEK293.
Extrakce pomocí silikátové pevné fáze
Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá a hodí se i pro automatizaci. Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt.
Izolace pomocí magnetických částic
Mezi nejmodernější izolační procesy patří magnetické částice, díky kterým se výrazně zkrátila doba separace a zvýšila výtěžnost. Spolu s vhodnými pufry umožňuje rychlou a účinnou purifikaci nukleových kyselin a proteinů přímo z buněčného lyzátu. Naproti tomu starší technologie jsou časově náročné kvůli několika extrakčním a centrifugačním krokům a také limitovány nízkou výtěžností.
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).
Příkladem takové technologie je ISOLATE II Plasmid Mini Kit, který umožňuje rychlou a velice účinnou izolaci čisté plazmidové DNA z bakteriální kultury. S ním je možné zpracovat 18 vzorků za 25 minut a dosáhnout vysoké kapacity až 40µg z 10ml kultury. Kit poskytuje protokoly pro izolaci low i high copy number plazmidů, P1 konstruktů, cosmidů, Gram-pozitivních bakterií a přečištění plazmidové DNA. Společnost Bioline - Meridian je zaměřená na vývoj, výrobu a prodej celé řady reagencií pro molekulární biologii, buněčnou analýzu, separaci nukleových kyselin a proteinů a purifikaci, čímž podporuje rozvoj těchto moderních izolačních metod.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
Srovnání metod izolace DNA
| Kriterium | Fenol-chloroformová extrakce | Extrakce silikátovou fází | Izolace magnetickými částicemi |
|---|---|---|---|
| Časová náročnost | Časově náročná | Relativně jednoduchá | Výrazně zkrácená doba separace |
| Výtěžnost | Vysoký výtěžek | Srovnatelná s magnetickými částicemi | Zvýšená výtěžnost, srovnatelná se silikátovou extrakcí |
| Čistota DNA | Vysoká čistota (zlatý standard) | Srovnatelná s magnetickými částicemi | Srovnatelná se silikátovou extrakcí |
| Použití nebezpečných chemikálií | Ano (fenol, chloroform) | Nejsou zmíněny jako standardní | Nejsou zmíněny jako standardní |
| Vhodnost pro automatizaci | Obtížně automatizovatelná | Hodí se pro automatizaci | Vhodná k automatizaci, především pro velké počty vzorků |
| Koncentrace izolované DNA | Standardní | Standardní | Možné získat koncentrovanější DNA |
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
tags: #izolace #plasmidove #dna