Izolace plasmidové DNA je v mikrobiologii důležitou a často využívanou metodou. Samotné izolaci předchází příprava bakteriálních kompetentních buněk a amplifikace plasmidů. Kvalita templátové DNA ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.
Metody izolace DNA
Pokud se DNA izoluje z buněk, je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu.
Fenol-chloroformová extrakce
Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA. Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny. Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol). Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).
V této práci jsou plasmidy CHR2, ASAP1, ASAP-3, ASAP-5 a Kir2.1. nejprve amplifikovány v bakteriích E.Coli kmenu DH5 a poté metodou fenol-chloroformové extrakce izolovány. K určení správnosti izolace slouží gelová elektroforéza a transfekce do buněčné linie HEK293.
Extrakce pomocí silikátové pevné fáze
Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
Magnetická separace DNA
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Magnetit (Fe3O4) a maghemit (γ-Fe2O3) jsou často používané magnetické nanočástice pro aplikace v biosensing a biomedicíně. Mohou být snadno nahromaděny nebo rozptýleny v roztoku a jejich povrch může být upraven oxidy (oxid křemičitý, oxid hlinitý) pro specifické interakce. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).
Tato technika využívá elektrostatické interakce DNA s povrchem částic. Jako zařízení pro separaci sloužil separátor (Biosan, Lotyšsko).
Optimalizace podmínek magnetické separace
Byla ověřena specifická a jednoduchá technika pro izolaci DNA. Výtěžnost izolace DNA pomocí fosfátového pufru I před imobilizací a 5 M NaCl po ní byla brána jako 100 %. Směrodatná odchylka stanovení (RSD) pro 5 měření byla 10,4 %. Při použití H2O byla RSD 18,1 %. Výtěžnost těchto podmínek byla nižší než v předchozím případě (34-37 %). Pro fosfátový pufr I (RSD 1,2 %) byl výtěžnost těchto podmínek nízký (23,5 %).
Dále bylo optimalizováno pH elučního roztoku Tris-EDTA. Byly testovány roztoky Tris-EDTA o pH 6,5 a Tris-HCl a Tris-EDTA o pH 9. Nejvyšší výtěžnost (100 %) byla stanovena u roztoku Tris-EDTA o pH 9. Ve srovnání s ostatními roztoky dosáhl roztok Tris-EDTA nejlepších výsledků. U stejného roztoku o pH 6,5 byla výtěžnost 36,9 %. Dále bylo ověřeno množství izolované DNA. Vyšší výtěžnosti izolace byly dosaženy, nicméně opakovatelnost byla zhoršena.
| Podmínky izolace | Výtěžnost (%) | RSD (%) |
|---|---|---|
| Fosfátový pufr I (před imobilizací) + 5 M NaCl (po imobilizaci) | 100 | 10.4 |
| H2O | 34-37 | 18.1 |
| Fosfátový pufr I | 23.5 | 1.2 |
| Tris-EDTA (pH 9) | 100 | N/A |
| Tris-EDTA (pH 6.5) | 36.9 | N/A |
Využití izolované DNA
Izolace DNA je klíčová pro mnoho molekulárně-biologických a diagnostických aplikací. Genomová DNA z klinického materiálu je nezbytná pro analýzu mutací a diagnostiku onemocnění, například rakoviny úst. Kromě toho, magnetické nanočástice nacházejí uplatnění jako značení buněk, jako kontrastní látky pro molekulární a buněčné zobrazování a pro separaci specifických látek z roztoku.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
K určení správnosti izolace slouží gelová elektroforéza a transfekce do buněčné linie HEK293. PCR produkt a imobilizační roztok byly promíchány a protřepány. Měření probíhalo po dobu dvou minut na povrch elektrody. Dále byly vyneseny do grafu.
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
tags: #izolace #plasmidove #dna #vyuziti