Kvalitně izolovaná nukleová kyselina je alfou a omegou v molekulární biologii 21. století. Doba, kdy se extrakce prováděla ručně pomocí fenol-chloroformu nebo xylenu, už pomalu odchází a tuto tradiční metodu na bázi toxických látek nahrazují kity. Mnoho biologických materiálů, zejména nukleových kyselin, skýtá při izolaci z jejich normálního prostředí výjimečné problémy. V posledních letech se navrhlo mnoho procedur a materiálů pro izolaci nukleových kyselin z jejich přirozeného prostředí, které využívaly jejich navazování na skleněné povrchy. Ukázalo se, že magnetické částice pokryté skleněným povrchem nabízí pro izolaci biologických materiálů značné výhody.
Principy a vlastnosti magnetických částic
Miniaturní částice s magnetickým jádrem a tenkou křemennou slupkou na povrchu se staly důležitou součástí nové technologie. Jsou to pevné materiály s malým průměrem. Tyto materiály, které jsou označené jako magnetické, jsou přitahovány k magnetu, tj. například feromagnetické nebo superparamagnetické materiály. Jako výhodný a preferovaný se odborníkům jeví supermagnetismus. Magnetické částice se můžou snadno soustředit na určitém místě v roztoku pomocí magnetu.
Mezi preferované magnetické materiály patří železo nebo oxidy železa, jako například magnetit (Fe3O4) nebo Fe2O3, přednostně γ-Fe2O3. V zásadě se můžou použít železitan barnatý, nikl, kobalt, slitiny Al-Ni-Fe-Co, nebo jiné feri- nebo feromagnetika. Magnetickými částicemi může být například magnetický pigment. Velikost magnetických částic je v nano rozsahu, tj. průměr je mezi 5 a 500 nm, lépe mezi 10 a 200 nm a ještě lépe mezi 15 a 50 nm.
Skleněné nebo organosilanové povrchy jsou často pro použití v biospecifických vazebných reakcích upravovány. Nebo se může skleněný nebo organosilanový povrch upravit různými rozpouštědly nebo solemi pro modifikaci jejich hydrofilnosti a/nebo jejich elektropozitivity. Nederivatizované silanolové skupiny skla nebo silanového povrchu můžou být za vhodných reakčních podmínek použité pro adsorpci pomocí pouhých fyzikálněchemických sil. Typicky jsou magnetická jádra nebo magnetické jaderné agregáty pokryté skleněným povrchem, který se vytvoří kyselinou- nebo zásadou-katalyzovaným sol-gel procesem. Tyto částice se nazývají částice typu jádro-plášť.
Magnetické skleněné částice (MGP) jsou relativně malé a jsou v podstatě kulovité. Nemagnetický jemný obsah směsi MGP je velmi nízký, díky metodě jejich přípravy. To má ten účinek, že suspenze MGP sedimentuje pomalu a může tak být výhodně využitá pro postupy v molekulární biologii, které se můžou automatizovat. MGP jsou skleněné kapičky, ve kterých jsou rozptýlené velice malé, neagregující magnetické částice. Doba poločasu pro sedimentaci 3 mg/ml směsi v izopropanolu je více jak 3 min., lépe 4 min., nebo ještě lépe 6 minut. Nejpreferovanější hodnota poločasu je ale více jak 10 minut, nebo dokonce více jak 20 minut. Čím jsou částice menší a čím více se blíží ideální kouli, tím déle budou MGP sedimentovat.
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
MGP mají přednostně povrch v rozsahu 5 až 100 m2/g, lépe v rozsahu 5 až 90 m2/g, ještě lépe v rozsahu 10 až 50 m2/g a nejlépe v rozsahu 15 až 30 m2/g. Tento povrch je zhruba dvojnásobný ve srovnání s částicemi popsanými v DE 195 37 985.
Aplikace magnetických částic v izolaci nukleových kyselin
Izolace nukleových kyselin pomocí magnetických částic je specifická a jednoduchá technika. Biospecifické vazebné analýzy umožňují detekci specifických analytů, např. nukleových kyselin nebo specifických vlastností analytů a hrají důležitou roli na poli diagnostik a bioanalytik. Purifikační efekt je výsledkem chování DNA nebo RNA, které se váží za určitých podmínek na magnetické skleněné částice, například za přítomnosti určité koncentrace chaotropní látky.
Postup izolace DNA magnetickými částicemi
MGP s navázanými DNA nebo RNA jsou poté raději alespoň jednou promyté, nejlépe směsí 70 objemových částí etanolu s 30 objemovými částmi vody („70% etanol). Poté se podmínky změní, tj. pro vymytí DNA nebo RNA navázaných na MGP částice se sníží koncentrace chaotropní látky. To se přednostně provede peletováním magnetických skleněných částic, například gravitací nebo použitím magnetu a resuspendováním v roztoku bez a nebo s nízkým obsahem chaotropní látky. Nebo se může případně roztok zředit roztokem bez a nebo s nízkým obsahem chaotropní látky.
Při přípravě homogenátu byl také testován vliv isopropanolu. Izolovaná DNA byla analyzována spektrofotometricky - byla zjišťována její koncentrace a čistota. Poté byla ověřována amplifikovatelnost DNA v PCR. Pro amplifikaci byly použity dvě sady primerů specifických pro rostlinnou ribosomální DNA. Produkty PCR s očekávanou délkou 700 a 220 bp byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Bylo zjištěno, že DNA izolovaná ze zrn cereálií, naklíčených zrn a cereálních výrobků pomocí testovaných magnetických nosičů byla v kvalitě vhodné pro PCR.
Optimalizace elučních roztoků
Při optimalizaci elučního roztoku Tris-EDTA byly testovány různé koncentrace roztoků Tris-EDTA o pH 6,5 a Tris-HCl a Tris-EDTA o pH 9. Nejvyšší výtěžnost (100 %) byla stanovena u roztoku Tris-EDTA o pH 9. U stejného roztoku o pH 6,5 byla výtěžnost 36,9 %. Dále byl ověřen počet cyklů, což mělo vliv na množství izolované DNA.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
| Roztok | pH | Výtěžnost DNA (%) | RSD (%) pro 5 měření |
|---|---|---|---|
| Tris-EDTA | 9,0 | 100 | - |
| Tris-EDTA | 6,5 | 36,9 | - |
| Promývací roztok | - | 34-37 | 18,1 (H2O) |
Automatizované systémy pro izolaci nukleových kyselin
RBC vyvinula a optimalizovala postupy tak, abyste docílili zaručeného výsledku, ať je váš zájem o DNA z krve či tkáně, z bakterií či rostlinných buněk, parafinových bločků nebo klidně total RNA. Celý proces je automatizovaný. Do UV dekontaminované komory vložíte stripy s napipetovanými vzorky a spustíte příslušný program. Automatické pipety, zahřívané bloky a magnet za vás udělají zbytek. Automatizací rutinních částí výzkumu nebo analýz ušetříte obrovské množství cenného času a hlavně zajistíte konzistenci.
Příklady automatizovaných systémů:
- ZEPHYRUS Magneto: Je přístroj na izolaci DNA/RNA. Je založen na principu izolace nukleových kyselin pomocí magnetických částic. Hroty jsou podle protokolu ponořovány do promývacích roztoků a postupně tak dochází k separaci DNA/RNA. Hroty jsou současně používány pro rozsuspendování pelety. Rotace hrotů umožňuje rychlé a důkladné promíchání. Během kroku míchání, kdy dochází k rozsuspendování pelety, je magnet vypnutý.
- Maxwell: Automatický izolátor nukleových kyselin Maxwell je kompaktním přístrojem, který využívá separaci pomocí magnetických částic magnetických tyčí. Vzorky se dávkují do předplněných kazet a magnetické tyče s návlekem následně přenáší částice s navázanou nukleovou kyselinou mezi jednotlivými promývacími roztoky až do elučního roztoku. Díky tomu, že stroj nevyužívá pipetování, nehrozí žádné ucpávání nebo úniky kapalin kvůli špatně nasazené či ucpané špičce.
Kity pro izolaci DNA a RNA
Promega nabízí kity pro izolaci DNA i RNA z celé řady matricí od běžných klinických vzorků jako je plná krev, plazma nebo stěry, po složitější vzorky, jako je stolice nebo rostlinná pletiva. Nově uvádí Promega na trh dva nové kity na rychlou velkoobjemovou izolaci cirkulující DNA (ccfDNA) a rychlou univerzální izolaci RNA i DNA z FFPE řezů.
Maxwell® RSC Rapid ccfDNA Kit
Maxwell® RSC Rapid ccfDNA Kit (kat.č. AS1590) od společnosti Promega představuje moderní řešení pro efektivní izolaci ccfDNA z lidské plazmy. Tento kit umožňuje rychlou a plně automatizovanou extrakci na přístroji Maxwell® RSC, díky čemuž poskytuje čistou a vysoce kvalitní DNA pro pokročilé molekulárně biologické aplikace. Umožňuje zpracování 1 až 4 ml plazmy najednou, což je dostatečné množství pro získání potřebné výtěžnosti DNA i pro náročné analýzy v rámci NIPT testování. Celý izolační proces trvá přibližně 45 minut a je plně automatizován na systému Maxwell® RSC, bez nutnosti ručního přenosu, centrifugace nebo filtrace. To zajišťuje maximální ochranu vzorku, omezení lidských chyb a vysokou mezioperační reprodukovatelnost. Maxwell® RSC Rapid ccfDNA Kit je ideálním nástrojem pro klinické laboratoře, které vyžadují rychlé, opakovatelné a vysoce kvalitní výsledky, například v rámci prenatální diagnostiky (NIPT) nebo onkologického screeningu.
Maxwell® RSC XtractAll FFPE DNA/RNA Kit
Maxwell® RSC XtractAll FFPE DNA/RNA Kit (kat.č. AS1570) od společnosti Promega představuje moderní a vysoce efektivní řešení pro izolaci nukleových kyselin z formalinem fixovaných a parafínem zalitých (FFPE) tkáňových vzorků. Po přípravě lyzátu z FFPE tkáňového vzorku si můžete zvolit, zda chcete izolovat DNA, RNA, celkové nukleové kyseliny (total NA), nebo provést sekvenční izolaci DNA a RNA. Bez ohledu na zvolený pracovní postup je potřeba pouze jedna kazeta na vzorek. Tato flexibilita je zvláště výhodná při práci se vzácnými nebo limitovanými vzorky, kdy si uživatel nemůže dovolit ztratit cenný biologický materiál. Ve spojení s automatizační platformou Maxwell® RSC je celý proces izolace výrazně zjednodušen - uživatel vloží lyzovaný vzorek a přístroj se postará o zbytek.
Vývoj nových technologií a spolupráce akademických pracovišť
Nanočástice jsou důležitou součástí nové technologie testování na Covid-19 vytvořené v Ústavu organické chemie a biochemie (ÚOCHB) Akademie věd ČR, která zásadně pomohla v době vrcholící koronavirové pandemie. Na požadavky kolegů z ÚOCHB rychle zareagovali vědci z Regionálního centra pokročilých technologií a materiálů (RCPTM) přírodovědecké fakulty. „Oxid křemičitý, který obaluje magnetické nanočástice, má velkou schopnost vázat nukleové kyseliny. Díky obrovskému povrchu nanočástic se na ně efektivně zachytí velké množství virové RNA. Nanočástice dokáže olomoucký tým vyrobit ve velkém. „V jednom cyklu jsme schopni připravit více než 100 gramů částic, které jsou použitelné pro zhruba 100 000 testů na Covid-19. Jedná se o technologicky nenáročnou syntézu.
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
Podle Pavla Šáchy z ÚOCHB byla právě izolace virové RNA úzkým hrdlem celého procesu přípravy nové technologie. „V době koronavirové krize nebyly dostupné zahraniční RNA izolační kity, proto jsme hledali v českých institucích vhodné magnetické částice schopné vázat virovou RNA. Technologii se podařilo úspěšně ověřit ve Státním zdravotním ústavu v Praze, v nemocnicích v Motole nebo Na Bulovce, v brněnském CEITECu, pražském BIOCEVu nebo olomouckém Ústavu molekulární a translační medicíny. Národní referenční laboratoř pro chřipku a nechřipková virová respirační onemocnění ze Státního zdravotního ústavu otestovala ÚOCHB-RCPTM RNA izolační kity a porovnala je se soupravami předních světových dodavatelů určenými pro izolaci nukleových kyselin - Roche a ThermoFisher Scientific. „ÚOCHB-RCPTM RNA izolační kit vykazoval zcela stejnou účinnost při izolaci ribonukleových kyselin. „Výsledky potvrdily, že naše magnetické částice jsou z hlediska účinnosti izolace virové RNA srovnatelné s komerčními materiály. S ohledem na produkční kapacitu a nižší výrobní náklady jsou proto plně připraveny na transfer do praxe. Celý vývoj nových izolačních souprav pro diagnostiku Covid-19 je ukázkovým příkladem spolupráce akademických pracovišť.
V tuzemsku vyvinuté sady budou moci pomáhat s diagnostikou při případných dalších vlnách onemocnění, a to nejen v České republice. „Věříme, že pokud najdeme výrobce, existuje potenciál dodávat soupravy pro izolaci RNA i do dalších zemí,“ uzavírá Pavel Šácha. ÚOCHB vede jednání s několika výrobci o poskytnutí licence na know-how a výrobu izolačních souprav, do jejich ukončení výrobu pro český a slovenský trh zajišťuje dceřiná společnost ústavu IOCB TECH.
tags: #informace #o #izolaci #magnetických #částic