Izolace DNA je klíčovým krokem v mnoha molekulárně-genetických vyšetřeních, ať už se jedná o polymerázovou řetězovou reakci (PCR) nebo jiné analýzy. Kvalita templátové DNA významně ovlivňuje účinnost následných reakcí. Nečistoty obsažené ve vzorku mohou působit jako inhibitory polymerázy nebo se vázat na templátovou DNA, čímž ji znepřístupňují pro reakci. Proto je nezbytné DNA purifikovat a zajistit její vysokou čistotu.
Homogenizace tkáně a lýza buněk
Pokud se DNA izoluje z buněk, například z tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem nebo leukocytů periferní krve, je prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů.
Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek, včetně všech nízkomolekulárních i vysokomolekulárních součástí tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu.
Extrakce a purifikace DNA
Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží. Nejčastěji používaným denaturačním a precipitačním činidlem bývá fenol. Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi, např. lipidy.
Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z roztoku, například jejím vysolením nebo pomocí jednoduchých alkoholů (etanolu nebo izopropanolu).
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
Fenol-chloroformová metoda
Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. I když je časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA. Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin.
Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny.
Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny.
Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol). Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).
Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
Extrakce pomocí silikátové pevné fáze
Tato metoda využívá křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá a hodí se i pro automatizaci.
Magnetická separace
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).
Další metody extrakce DNA jsou založené např. na iontoměničové chromatografii.
| Metoda izolace DNA | Výhody | Nevýhody |
|---|---|---|
| Fenol-chloroformová extrakce | Vysoký výtěžek, vysoká čistota DNA | Časově náročná, nebezpečné chemikálie, obtížná automatizace, nutnost odstranění zbytků fenolu a chloroformu |
| Silikátová pevná fáze | Relativně jednoduchá, vhodná pro automatizaci | |
| Magnetická separace | Vhodná pro automatizaci, zpracování velkého počtu vzorků, koncentrovanější DNA |
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
tags: #izolace #DNA #princip #metody