Testy DNA, genetické testování a genetická analýza představují velice široký pojem. Zahrnuje nejrůznější vyšetřovací a detekční metody, které analyzují DNA, její dynamiku a regulaci nejen v buňkách lidského těla. Moderní genetická analýza je založená na analýze genetického materiálu v podobě DNA, RNA, mitochondriální DNA (mtDNA) nebo volné DNA (cfDNA). Princip izolace tohoto materiálu je až na menší specifika stejný.
Izolace a purifikace DNA
Pokud se DNA izoluje z buněk (např. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží.
Fenol-chloroformová metoda
Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.
Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny. Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny. Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol), v níž je DNA nerozpustná. Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).
Extrakce pomocí silikátové pevné fáze
Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
Magnetická separace
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).
Metody analýzy DNA
Existuje několik základních metod používaných při analýze DNA:
Polymerázová řetězová reakce (PCR)
PCR, jinak také polymerázová řetězová reakce, je nejspíš nejvíce používanou laboratorní metodou, která slouží k amplifikaci (namnožení) úseků DNA. Cílem této metody může být jak samotná detekce přítomnosti určité sekvence DNA, tak zmnožení konkrétního úseku, který je následně využit v dalších metodách. Principem je navržení a užití primerů neboli sond, tedy krátkých úseků DNA, které specificky rozeznají zvolenou sekvenci, před jejíž začátek a konec nasedají a tím ji označí pro polymerázu, která pak po zvýšení teploty nad požadovanou mez tento úsek zkopíruje do nově syntetizované molekuly a po snížení teploty odpadne.
Začíná-li molekulárně-genetické vyšetření polymerázovou řetězovou reakcí, stačí někdy jako vzorek velmi malé množství DNA. Někdy lze dokonce použít přímo část tkáně nebo několik buněk lyzovaných např. hydroxidem, tenzidy nebo zmrazováním a rozmrazováním. Kvalita templátové DNA nicméně ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.
Real-time PCR (qPCR)
Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (nejčastěji označovaná jako Real-time PCR nebo qPCR) je metoda založena na principu klasické PCR, umožňuje však kvantifikaci sledovaného úseku DNA. Záznam amplifikace je založen na principu fluorescence, kdy se používají značené sondy (fluorescenční látky), které se váží specificky nebo nespecificky na amplifikované úseky DNA. Fluorescence a její intenzita je snímána během celé reakce a následně počítačově vyhodnocována. Na rozdíl od běžné PCR, kde se analyzuje až výsledný produkt pomocí elektroforézy v agaróze, je při Real-time PCR zaznamenáván každý cyklus PCR ve skutečném čase.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
Elektroforéza
Úseky DNA, produkty PCR nebo produkty štěpení DNA můžeme analyzovat pomocí separačních metod jako chromatografie nebo elektroforéza (ELFO). Elektroforetické dělení na agarózovém nebo akrylamidovém gelu patří mezi nejpoužívanější metody separace DNA. DNA nesoucí záporný náboj se pohybuje v jednosměrném elektrickém poli od katody k anodě.
Sekvenování DNA
Sekvenování nebo také sekvenace je metoda určená ke čtení genetického kódu čili k determinaci primárního pořadí (sekvence) nukleotidových bází v dvouřetězci DNA. Byly vyvinuty dvě metody - Sangerova (dideoxy chain termination method) a Maxam-Gilbertova metoda (chemické degradace). Základem je použití směsi standardních deoxynukleotidtrifosfátů (dNTPs) a modifikovaných dideoxynukleotidtrifosfátů (ddNTPs) při přípravě úseku DNA, který bude sekvenován. Modifikovaný ddNTPs má za následek ukončení syntézy DNA. Celý proces probíhá ve 4 separátních enzymových reakcích. Každá obsahuje - templátovou DNA v jednovláknové podobě, DNA-polymerasu, primer, 4 dNTPs a modifikovaný nukleotid dideoxynukleotidtrifosfát (ddNTPs). V každé ze 4 reakcí je jiný ddNTP - ddATP, ddGTP, ddCTP, nebo ddTTP. Po skončení sekvenace jsou molekuly DNA separovány kapilární elektroforézou - produkty procházejí kapilárou, kde se dělí dle velikosti. Dnes je sekvenování již plně automatizováno, čímž se značně snížila její pracnost a náročnost na čas. V poslední době se objevilo několik zcela nových metod, které dovolují řádově vyšší rychlost sekvenace a které souhrnně označujeme jako metody druhé generace (next generation sequencing). I tyto moderní metody sekvenování stejně jako klasické vyžadují následnou pracnou bioinformatickou analýzu při sestavování „přečtených“ úseků, neboť výstupem každého sekvenování není ucelená sekvence nukleotidů, nýbrž tzv. čtení (reads).
Hybridizace DNA
Hybridizace nukleových kyselin (NK) spočívá v denaturaci dvoušrobovice DNA a následné renaturaci, což je spojování podle pravidel párování bazí. Může nastat mezi dvěma vlákny DNA, DNA a RNA, nebo RNA a RNA. Molekula DNA nebo RNA, která může být na základě hybridizace využita k detekci komplementární sekvence nukleové kyseliny, se nazývá sonda. Sondy musí být použity v jednovláknové podobě a označené tak, aby bylo možné hybridizační reakci zviditelnit. Jako sondy mohou být využity - klonované sekvence DNA, sekvence získané PCR, syntetické oligonukleotidy, RNA získání transkripcí klonované DNA in vitro. Po izolaci genetického materiálu je třeba uchytit vzorek DNA na sondy, které mikročip obsahuje, přičemž na jednom mikročipu je jich hned několik milionů najednou. Tato fáze využívá mechanismus hybridizace, kdy je DNA fragmentována, a pouze takový fragment, jehož sekvence odpovídá sekvenci dané sondy, se na tuto sondu naváže. Celý krok hybridizace je časově náročný a trvá několik dnů.
DNA mikročip je obvykle skleněná destička, na které jsou připojeny tisíce různých sekvencí DNA v určitém pořadí. V dalším kroku je mikročip s již hybridizovanou a značenou DNA skenován scannerem s vysokým rozlišením typu iScan. Jedná se o plně automatizovaný proces s možností opakování, pokud jsou výsledky nejednoznačné nebo neúplné. Posledním krokem je pak samotná analýza získaných dat. Tento krok je s ohledem na objem dat nejzdlouhavější. Analýza je prováděna na počítači speciálním softwarem.
Restrikční analýza DNA
Restrikční analýza DNA je metodou charakterizace DNA pomocí jejího štěpení restrikčními endonukleázami (RE) na fragmenty. RE jsou bakteriální enzymy, které štěpí dvouvláknovou DNA ve specifických sekvencích. Enzymy chrání bakterie před vniknutím cizorodé DNA. Endonukleasy štěpí DNA tak, aby vznikaly přečnívající úseky tzv. kohezní nebo lepivé konce a fragmenty DNA, které mají definovanou délku. Restrikční endonukleasy mohou štěpit rekombinantní molekuly DNA za účasti enzymu DNA-ligasy a komplementarity mezi lepivými konci, např. enzym EcoRI izolovaný z E. coli. Počet i délka fragmentů je pro daného jedince specifická. Identifikace a analýza produktů štěpení se provádí elektroforetickým dělením na gelu nebo kapilární elektroforézou. Odlišení různých vzorků DNA se provádí na základě polymorfismu délky štěpných úseků. Tento polymorfismus vzniká na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti rozpoznávacích a štěpných míst.
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
Základem je izolace a purifikace DNA, následné štěpení restrikčním enzymem za vzniku tisíců různě velkých fragmentů. Dalším krokem je elektroforetické rozdělení podle velikosti fragmentů. Poté je gel ponořen do alkalického roztoku, díky kterému se DNA denaturuje. Následuje blotting, což je přenesení denaturovaných fragmentů na membránu, která je vystavena teplotě 80 °C a fragmenty se na ní fixují.
Klonování genů a selektivní namnožení fragmentů DNA
Selektivní namnožení specifických fragmentů DNA z genomové DNA nebo cDNA je klíčovou technikou. Díky objevení enzymů - restrikčních endonukleas - bylo umožněno získat různě dlouhé fragmenty, které mohou být dále analyzovány. Samotné množení je založeno na tvorbě rekombinantních molekul DNA, které vznikají spojením různých úseků molekul DNA pocházejících z taxonomicky odlišných druhů. Další důležitá DNA molekula nezbytná pro množení DNA je tzv. vektor, do kterého je fragment DNA vložen. Rekombinovaný vektor je poté vnesen do hostitelského organismu.
Využití analýzy DNA
Analýza DNA má široké spektrum využití v různých oblastech:
- Testování otcovství: Spolehlivé testy otcovství, které mohou být provedeny i anonymně.
- Forenzní genetika: Klíčový význam pro identifikaci pachatelů trestných činů, ačkoli je třeba brát v úvahu rizika chybovosti a interpretace.
- Genetická genealogie: Získávání informací o rodových liniích, původu a nalezení příbuzných.
- Prediktivní genetická analýza: Rozbor možných genetických predispozic pro choroby a metabolické odlišnosti před prvními projevy.
- Stanovení karyotypu: Detekce správného počtu chromozomů a vyloučení zásadních chromozomových aberací.
- Analýza mitochondriální DNA (mtDNA): Studium genů v mitochondriích, které kódují jen několik genů, ale jsou důležité pro chod buněk.
Rizika a spolehlivost analýzy DNA
I přes vysokou spolehlivost analýzy DNA je třeba brát v úvahu potenciální rizika a faktory ovlivňující její přesnost:
- Znečištění vzorku: Chybovost genetické analýzy může v kriminalistice dosahovat 2 až 5 %. Důraz je kladen na akreditaci laboratoří a zamezení kontaminace vzorku DNA.
- Chybná interpretace: Humanitně vzdělaný soudce spoléhá na posudek znalce, který však nemusí mít vystudovanou genetiku nebo má v oboru mizivé zkušenosti.
- Stáří vzorku: U vzorků DNA nelze přesně určit jejich stáří, což může vést k zavlečení DNA nevinné osoby na místo činu.
- Chybovost: Studie ukázaly, že chybné závěry mohou nastat, ačkoli se často týkají marginálních aspektů.
Vliv znečištěného ovzduší na DNA
Znečištěné ovzduší způsobuje zdravotní problémy spojené se záněty, změnami v DNA a smrtí buněk. Může zhoršovat nemoci jako astma a přispívat ke vzniku Alzheimerovy choroby. Imunitní systém částice rozpozná jako hrozbu a aktivuje se, přičemž může vzniknout zánět. Dalším následkem škodlivin je oxidační stres, při kterém nadbytek nestabilních molekul v těle způsobuje poškození nebo smrt jinak zdravých buněk nebo změny v DNA.
Vliv znečištěného ovzduší má vliv na zhoršení genetických vlastností spermií, konkrétně na takzvanou integritu chromatinu, tedy komplexu DNA a některých proteinů. Výzkum sledoval dopad ovzduší na funkční a genetické vlastnosti spermií u skupin městských strážníků v Ostravě, Praze a v Českých Budějovicích.
| Lokalita | Průměrná čtvrtletní koncentrace benzo[a]pyrenu (1. čtvrtletí) | Průměrná čtvrtletní koncentrace benzo[a]pyrenu (3. čtvrtletí) | Medián narušení chromatinu (jaro) | Medián narušení chromatinu (podzim) |
|---|---|---|---|---|
| Ostrava | 4,6 nanogramů/m³ | 0,6 nanogramů/m³ | 22,6 % | 18,6 % |
| České Budějovice | Výrazně nižší | Výrazně nižší | Hraniční | Hraniční |
| Praha | Výrazně nižší | Výrazně nižší | Nebyly statisticky významné rozdíly | Nebyly statisticky významné rozdíly |
Výsledky projektu jasně prokazují, že znečišťující látky v ovzduší podstatně přispívají k narušení DNA ve spermiích. Zhoršená oplozovací schopnost byla dosud popsána u mužů s více než 15 procenty spermií s narušeným chromatimem. Další část studie se zaměřila na biologický monitoring strážníků a jejich zatížení škodlivými chemickými látkami. Výzkum prokázal zvýšené hladiny hydroxylovaných metabolitů polycyklických aromatických uhlovodíků v moči ostravských strážníků. Tyto látky jsou sledovány například z důvodu jejich karcinogenních účinků.
tags: #izolace #a #analyza #dna #přehled