Vzorky tkání fixovaných formalínem a zalitých v parafínu (FFPE) se běžně používají pro přípravu histologických preparátů. U těchto preparátů lze použít přehledná či speciální barvení pro zvýraznění požadovaných struktur nebo použitím protilátek (imunohistochemie) označit a vizualizovat zcela konkrétní typy molekul. Tyto ošetřené vzorky (FFPE) se skladují desítky let.
Dnešní postupy izolace nukleových kyselin (NA) umožňují izolaci DNA a RNA i z takto ošetřených tkání a využít tak tyto vzorky k analýze DNA a RNA, přestože pro tyto analýzy tyto vzorky nebyly původně určeny. Výhodou možnosti izolovat RNA z parafínových bločků je skutečnost, že se dostáváme k materiálu - celkové RNA, která by byla za normálních okolností nedostupná (bločky z archivu). RNA je rychle degradována, a takto staré vzorky vhodné pro izolaci RNA nejsou jinak dostupné.
Nevýhodou je, že musíme počítat s omezeními pro následné analýzy. RNA je fragmentovaná, v méně čisté podobě, často máme omezený výtěžek a následné analýzy je tomu třeba přizpůsobit.
Obecné principy izolace nukleových kyselin
Pokud se DNA izoluje z buněk (např. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží.
Kvalita templátové DNA ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se vážou na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci. Inhibují reakce katalyzované terminální transferázou nebo polynukleotid kinázou. Neinterferují s určováním koncentrace RNA/DNA.
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
Metody extrakce a purifikace DNA
Mezi hlavní metody extrakce a purifikace DNA patří:
- Organická extrakce (fenol-chloroformová metoda)
- Extrakce pomocí silikátové pevné fáze
- Magnetická separace
Fenol-chloroformová metoda
Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA. Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny.
Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny. Poté se DNA vysráží z vodného roztoku.
Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol). Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).
Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.
Čtěte také: IPA asfaltová izolace: Co potřebujete vědět
Extrakce pomocí silikátové pevné fáze
Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.
Magnetická separace
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).
Magia 12 DSX je kompaktní systém pro automatickou izolaci nukleových kyselin pomocí magnetických partikulí. Předdefinované protokoly, reagencie připravené v jednorázových reagenčních náplních, jednorázový spotřební materiál a plně automatizovaný proces zaručují standardizovaný průběh a vysokou reproducibilitu při extrakci nukleových kyselin z nejrůznějších vstupních materiálů. Magia 12 DSX poskytuje kapacitu zpracování 1 - 12 vzorků současně. Ovládání a údržba jsou uživatelsky nenáročné a probíhají prostřednictvím vestavěné klávesnice s LCD displejem a čtečky čárových kódů. Pracovní protokoly jsou naprogramované a uložené v paměti přístroje, nastavení vstupního a elučního objemu je možné přizpůsobit dle požadavků operátora. Izolace nukleových kyselin probíhá prostřednictvím vazby nukleových kyselin na magnetické partikule a na jejich následném vyvázání do elučního pufru. Reagencie jsou připravené v jednorázových reagenčních náplních - odpadá nutnost reagencie uchovávat v reservoárech a kontrolovat jejich množství a stav. Součástí kitů je sada jednorázového spotřebního plastového materiálu, který je k procesu extrakce zapotřebí. Jedná se o reakční komoru, ve které probíhá celý proces izolace nukleových kyselin; dále o propichovací hroty, sloužící k otevření fólie na reagenčních náplních, a o jednorázové špičky s filtrem určené k pipetování a přenášení reagencií. Propichovací hroty a špičky jsou v přístroji uloženy v plastovém držáku, jenž je také součástí kitu. Izolaci je možné provést z různých vstupních materiálů.
Porovnání izolace RNA a gDNA
Zatímco izolace gDNA si klade za cíl získat intaktní, vysoce čistou a nefragmentovanou DNA pro genotypizaci a jiné analýzy, izolace RNA se potýká s její nestabilitou a náchylností k degradaci, zejména u archivních vzorků FFPE. Proto je u RNA často nutné počítat s fragmentací a nižší čistotou.
| Parametr | Izolace gDNA | Izolace RNA |
|---|---|---|
| Stabilita molekuly | Vysoká (méně náchylná k degradaci) | Nízká (rychle degraduje) |
| Cíl izolace | Intaktní, vysoce čistá DNA | Celková RNA (často fragmentovaná) |
| Vhodnost pro archivní vzorky FFPE | Vysoká | Možná, ale s omezeními (degradace, fragmentace) |
| Omezení pro následné analýzy (FFPE) | Minimální | Fragmentace, nižší čistota, omezený výtěžek |
| Použitelnost pro PCR | Vysoká (malé množství postačuje) | Vyžaduje reverzní transkripci na cDNA před PCR |
Další metody extrakce DNA
Další metody extrakce DNA jsou založené např. na použití chelačních pryskyřic.
Čtěte také: Radon a asfaltová izolace
Začíná-li molekulárně-genetické vyšetření polymerázovou řetězovou reakcí, stačí někdy jako vzorek velmi malé množství DNA. Někdy lze dokonce použít přímo část tkáně nebo několik buněk lyzovaných např. hydroxidem, tenzidy nebo zmrazováním a rozmrazováním.
tags: #rozdíly #mezi #izolací #RNA #a #izolací