I přes nesporný význam metod studia diverzity ekosystémů jsou nejrozšířenějšími postupy metody založené na studiu genetické informace uložené v DNA a RNA. K jejich využití je nukleové kyseliny nutné z biologického materiálu nejprve izolovat, separovat a koncentrovat. Pro izolaci půdní mikrobiální DNA existují dva základní postupy: přímá (in situ) a nepřímá (ex situ) izolace. V případě přímé izolace jsou mikrobiální buňky lyzovány přímo v půdní matrici, zatímco při nepřímé izolaci jsou nejprve extrahovány z půdy.
Výzvy při izolaci DNA z půdního prostředí
Půda je komplexní prostředí sestávající z fáze pevné, tekuté a plynné. Důsledkem soustředění mikrobiálních buněk v mikropórech a jejich schopnosti poutat minerální částice půdy je snížená dostupnost buněk pro většinu lytických postupů a jejich uvolnění z půdní matrice není snadné. Metody izolace mikrobiální frakce se liší způsoby mechanického ošetření půdy, složením pufru pro homogenizaci i způsobem extrakce mikrobiální frakce po homogenizaci.
Klasické postupy extrakce nukleových kyselin
Prvním krokem je volba vhodného pufru, ve kterém se uskuteční vlastní lyze mikrobiálních buněk. Úlohou pufru je zajistit vhodné prostředí pro lyzi, zabránit degradaci DNA a v případě přímé extrakce zabránit vazbě nukleových kyselin na půdní koloidy. Za tradiční pufr lze označit fosfátový pufr, který však uvolňuje mnoho huminových látek. Další velkou skupinu tvoří pufry s různým obsahem EDTA a Tris-HCl.
| Látka/Pufr | Využití |
|---|---|
| Cholát sodný | Disperze polymerů poutajících buňky k matrici |
| Lysozym | Enzymatická lyze peptidoglykanu |
| Fenol-chloroform | "Zlatý standard" purifikace, denaturace bílkovin |
| Chaotropní soli | Vazba DNA na silikátové/skleněné povrchy |
Mechanické a enzymatické metody lyze
Metody používané k lyzi mikrobiálních buněk lze rozdělit na mechanické a chemicko-enzymatické. Nejběžnějším mechanickým ošetřením je intenzivní třepání půdní suspenze se skleněnými kuličkami. Velmi účinnou variantou je tzv. bead-beating, kde kromě homogenizace vzorku dochází i k mechanické lyzi části buněk. Nejčastěji používaným enzymatickým ošetřením je působení lysozymu, který hydrolyzuje peptidoglykan bakteriální buněčné stěny. Kromě lysozymu bývá často užívána proteináza K, širokospektrá serin-proteáza, která částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny.
Purifikace pomocí organické extrakce a pevných fází
Fenol-chloroformová technika je stále považována za „zlatý standard“ purifikace nukleových kyselin. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Pro automatizaci jsou však vhodnější metody využívající křemičité kuličky nebo magnetickou separaci.
Čtěte také: Magnezitové cihly
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem, jako je silikát nebo iontoměnič. Magnetické částice pokryté skleněným povrchem nabízejí značné výhody - snadno se soustředí pomocí magnetu a umožňují získat izolovanou DNA ve vysoké čistotě a koncentraci. Tyto systémy jsou dnes klíčové pro automatizovanou přípravu vzorků v molekulární biologii.
Čtěte také: Zahradní design s cihlami
Čtěte také: OSB desky v praxi
tags: #acetat #draselny #vyuziti #pri #izolaci #dna