Izolace DNA je základním krokem v mnoha molekulárně-genetických vyšetřeních a biotechnologických aplikacích. Cílem je získat dostatečné množství čisté a nepoškozené DNA z biologického materiálu. Kvalita templátové DNA ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se vážou na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.
Zdroje DNA a výběr metody
DNA lze teoreticky izolovat z jakékoliv živočišné tkáně obsahující živé buňky. U organismů malé velikosti se k izolaci používá i celých jedinců. V tomto případě však samozřejmě hrozí kontaminace parazity, symbionty a potravou. U jednobuněčných živočichů se někdy používá postup, při kterém se nejprve daný jedinec (nebo několik jedinců) rozmnoží a DNA je potom izolována ze všech jedinců najednou. U obratlovců, jejichž erytrocyty mají jádro, se dá DNA snadno izolovat z krve. Běžně se tak například izoluje DNA i z malých druhů ptáků. U savců je izolace DNA z krve problematičtější a vyžaduje poměrně velké množství (několik mililitrů) krve. U malých savců nebo obojživelníků sice velmi kvalitní DNA získáme z čerstvé ledviny nebo svaloviny, obvykle však vystačíme například s odstřihnutým koncem ocásku nebo částí prstu, takže zvíře nemusíme usmrtit. Při použití speciálních technik je možné izolovat DNA i z takových zdrojů, jako jsou jednotlivé chlupy nebo trus. Tyto techniky však jsou poměrně obtížné a citlivé na kontaminaci. Často lze izolovat DNA i z muzejního materiálu. Dobrým zdrojem DNA jsou hlavně tkáně uchovávané v lihu. Naopak izolace DNA ze vzorků, které přišly do styku s formalínem, často končí neúspěchem. DNA lze občas získat i z velmi starých vzorků (řádově i desítky tisíc let starých). DNA byla úspěšně izolována z fosilních kostí (např. z neandrtálce) nebo z hmyzu uchovaného v jantaru. Větší naději na úspěch lze očekávat v případě, že kost byla dlouhou dobu v chladném prostředí (například v permafrostu). Při takovýchto izolacích je však třeba postupovat velmi opatrně a pečlivě, neboť riziko kontaminace je veliké. Používají se speciální přetlakové místnosti v budovách, kde nejsou žádné další molekulární laboratoře a pracovníci používají speciální obleky připomínající skafandry, aby maximálně omezili kontaminaci vzorku svou vlastní DNA.
Volba metody extrakce DNA závisí na tom, k čemu ji budeme dále používat. V některých případech vystačíme i s DNA horší kvality a v nízké koncentraci. V extrémním případě můžeme použít i jen zlyzované buňky. S kvalitně izolovanou DNA se nám však vždy bude pracovat lépe. Pro izolaci se používá celá řada různých protokolů a v poslední době se také často používají komerčně vyráběné soupravy (kity), které však bývají dražší. Ve většině případů však spolehlivě funguje klasická metoda založená na odstranění proteinů pomocí enzymu proteinázy K, extrakce směsí fenolu s chloroformem a precipitaci čistým lihem.
Princip a postup izolace DNA
Pokud se DNA izoluje z buněk (např. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží. Nejčastěji používaným denaturačním a precipitačním činidlem bývá fenol. Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi. Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z roztoku např. jejím vysolením nebo pomocí jednoduchých alkoholů (etanolu nebo izopropanolu). Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin.
Fenol-chloroformová metoda
Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA.
Čtěte také: Kompletní průvodce lopatovou metodou
- Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány.
- Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny.
- Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny.
- Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol). Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu.
- Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).
Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.
Modifikace a alternativní metody
Snaha maximálně zjednodušit laboratorní protokoly vedla k řadě modifikací izolace DNA. Jednou z nich je nahrazení pufru s proteinázou roztokem obyčejného pracího prášku ve vodě (0,025g/ml). Tkáň se však v tomto případě musí v roztoku prášku dokonale homogenizovat. Při použití kvalitního extrakčního pufru s proteinázou K není tento krok nutný. Další modifikace se používá k izolaci DNA, určené pro její následující amplifikaci pomocí PCR - v tomto případě je extrakční pufr v zásadě shodný s pufrem používaným při této metodě (s tím, že i v tomto případě musíme přidat proteinázu). Při izolaci tkání uchovávaných ve formalínu se v prvních krocích izolace někdy přidává DTT (až ve 100mM koncentraci) nebo se využívají speciální kity.
Extrakce pomocí silikátové pevné fáze
Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.
Magnetická separace
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).
Automatizované systémy pro izolaci DNA
Magia 12 DSX je kompaktní systém pro automatickou izolaci nukleových kyselin pomocí magnetických partikulí. Předdefinované protokoly, reagencie připravené v jednorázových reagenčních náplních, jednorázový spotřební materiál a plně automatizovaný proces zaručují standardizovaný průběh a vysokou reproducibilitu při extrakci nukleových kyselin z nejrůznějších vstupních materiálů. Magia 12 DSX poskytuje kapacitu zpracování 1 - 12 vzorků současně. Ovládání a údržba jsou uživatelsky nenáročné a probíhají prostřednictvím vestavěné klávesnice s LCD displejem a čtečky čárových kódů. Pracovní protokoly jsou naprogramované a uložené v paměti přístroje, nastavení vstupního a elučního objemu je možné přizpůsobit dle požadavků operátora. Izolace nukleových kyselin probíhá prostřednictvím vazby nukleových kyselin na magnetické partikule a na jejich následném vyvázání do elučního pufru. Reagencie jsou připravené v jednorázových reagenčních náplních - odpadá nutnost reagencie uchovávat v reservoárech a kontrolovat jejich množství a stav. Součástí kitů je sada jednorázového spotřebního plastového materiálu, který je k procesu extrakce zapotřebí. Jedná se o reakční komoru, ve které probíhá celý proces izolace nukleových kyselin; dále o propichovací hroty, sloužící k otevření fólie na reagenčních náplních, a o jednorázové špičky s filtrem určené k pipetování a přenášení reagencií. Propichovací hroty a špičky jsou v přístroji uloženy v plastovém držáku, jenž je také součástí kitu.
Čtěte také: Akrylový Pouring: Průvodce tekutou malbou
Izolaci je možné provést z různých vstupních materiálů. Někdy lze dokonce použít přímo část tkáně nebo několik buněk lyzovaných např. hydroxidem, tenzidy nebo zmrazováním a rozmrazováním.
Koncentraci izolované DNA určíme spektrofotometrem, nebo pomocí elektroforézy v málo koncentrovaném agarozovém gelu a srovnáním se standardy, které naneseme na gel společně se studovaným vzorkem. Izolovanou DNA před použitím obvykle zředíme vodou a zásobní koncentrovaný roztok uchováme v mrazničce.
| Metoda | Výhody | Nevýhody | Automatizace |
|---|---|---|---|
| Fenol-chloroformová | Vysoký výtěžek, vysoká čistota | Časově náročná, nebezpečné chemikálie, obtížná automatizace | Nízká |
| Silikátová pevná fáze | Relativně jednoduchá | Vhodná | |
| Magnetická separace | Vhodná pro velké počty vzorků, koncentrovaná DNA | Vhodná (vysoká) | |
| Magia 12 DSX (automatizovaný systém) | Standardizovaný průběh, vysoká reproducibilita, uživatelsky nenáročná obsluha | Vyšší pořizovací náklady | Plně automatizovaná |
Čtěte také: Průvodce kročejovou izolací
tags: #alkalicka #metoda #izolace #dna #princip #postup